液质联用“接口”技术的发展历程

液质联用“接口”技术的发展历程

自20 世纪70 年代初，人们开始致力于液-质联用接口技术的研究。在开始的20 年中处于缓慢的发展阶段，研制出了许多种联用接口，但均没有应用于商业化生产。直到大气压离子化（atmospheric-pressure ionization, API）接口技术的问世，液-质联用才得到迅猛发展，广泛应用于实验室内分析和应用领域。

液-质联用接口技术主要是沿着三个分支发展的：

（1）流动相进入质谱直接离子化，形成了连续流动快原子轰击（continuous-flow fast atom bombarment, CFFAB）技术等；

（2）流动相雾化后除去溶剂，分析物蒸发后再离子化，形成了“传送带式”接口（moving-belt interface）和离子束接口（particle-beam interface）等；

（3）流动相雾化后形成的小液滴解溶剂化，气相离子化或者离子蒸发后再离子化，形成了热喷雾接口（thermo spray interface）、大气压化学离子化（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）和电喷雾离子化（electrospray ionization, ESI）技术等。有关液相质谱的接口技术和LC-MS 技术的发展，Niessen 曾经进行了较为详细的综述。

1 液体直接导入接口

1972 年，Tal’roze 等人提出了直接将色谱柱出口导入质谱的思想，当时称之为毛细管入口界面。相继有许多研究组开展这方面的研究，在1980 年这种液质接口已经用于商业化生产。为了避免非挥发溶剂的污染，Melera 使用一个小的横隔膜对这一接口进行了改进，研制成了液体直接导入接口（direct liquid introduction interface）技术。该接口是将液相色谱的流动相沿着进样杆流动，然后通过一个直径为3-5µm 的针孔，使液体射入质谱计的CI 离子源中。采用传统的CI 离子源可以很容易地把色谱与质谱计相连或脱开。

液体直接导入接口的优点是：接口简单，造价低廉，可将非挥发性和热不稳定性的化合物温和地转化成气态，样品以溶液状态进入质谱形成了CI 条件，可得到分子量信息。缺点是：分流过程中需要减少大量的流动相，使用的隔膜经常堵塞。

2 连续流动快原子轰击

1985 和1986 年，快原子轰击（FAB）和连续流动快原子轰击（CFFAB）接口技术相继问世，并随后投入了商业化生产。快原子轰击是用加速的中性原子（快原子）撞击以甘油调和后涂在金属表面的有机物（“靶面”），导致这些有机化合物的电离。分析物经中性原子的撞击获取足够的动能以离子或中性分子的形式由靶面逸出，进入气相，产生的离子一般是准分子离子。在此基础上发展的连续流动快原子轰击技术，得到更广泛的应用。其甘油的浓度在2%-5%之间，比静态的FAB使用的甘油量少，且测定过程中“靶面”得到不断更新，其化学物理性质变化很小，同时经色谱分离后的共存物质不会同时出现在“靶面”上，因此大大降低了噪声，信噪比提高，定量分析的重现性也得到改善。

连续流动快原子轰击接口的优点：是一种“软”离子化技术，适用于分析热不稳定、难以汽化的化合物，尤其是对肽类和蛋白质的分析在当时是最有效的。缺点是：只能在较低的流量下工作，一般小于5µl/min，大大限制了液相柱的分离效果，流动相中使用的甘油会使离子源很快变脏，同时容易堵塞毛细管，混合物样品中共存物质的干扰也会抑制分析物的离子化，降低灵敏度。

3 “传送带式”接口

1977 年，世界上第一台商业化生产的液-质联用接口就是使用传送带式（moving-belt, MB）技术，是由Mac Fadden 等人对前人研制的传送线式接口技术的改进。该接口是液相的流动相不停地由传送带送入质谱离子源，传送带可根据流动相的组成进行调整。在传送过程中，样品闪蒸解离进入离子源，在进入离子源前通过两个不同的泵和真空阀在减压条件下加热除去流动相，可以连接EI、CI 或FAB。在分析未知化合物时，可连接EI 分析，获得的谱图可以在质谱数据库检索。分析大分子生物样品时，多选用FAB。在CI 条件下，当样品与CI 等离子体完全接触的状态下才可获得最佳结果。

传送带式接口的优点是：对挥发性溶剂的传送能力高达1.5ml/min，对纯水会减少至0.5ml/min；喷射装置与传送带表面呈45o 夹角时，可以改善色谱积分曲线；非挥发性缓冲液可以从传送带上除去，可以使用非挥发性缓冲溶液；对样品的收集率和富集率都较高。缺点是：传送带的记忆效应不易消除，检测信号的背景值较高，只能分析热稳定性的化合物。

4 离子束接口

离子束接口（ particle-beam interface,PB ） 是从单分散气溶胶界面（monodisperse aerosol generating interface for chromatography, MAGIC）发展来的。该接口将液相色谱的流动相在常压下借助气动雾化产生气溶胶，气溶胶扩展进入加热的去溶剂室，此时待测分子通过一个动量分离器与溶剂分离，然后经一根加热的传送管进入质谱。分析物粒子在离子源与热源室的内壁碰撞而分解，溶剂蒸发后释放出气态待测分子即可进行离子化。

离子束接口的优点是：分析范围比热喷雾接口更宽，将电离过程与溶剂分离过程分开，更适合于使用不同的流动相，不同的分析物质；主要用于分析非极性或中等极性，分子量小于1,000 的化合物，在药残、药物代谢分析、化工方面曾有许多成功的实例分析。其缺点是：灵敏度变化范围大，线性响应的浓度范围较窄，两种化合物的协同洗脱会对响应产生不可预测的效应，使用高速氦气造价太高，离子化手段仍然是电子轰击，不适于分析热不稳定的化合物。

5 热喷雾接口

热喷雾接口（thermo spray interface）是从20 世纪70 年代中期开始在美国休斯顿大学实验室立项研究，旨在解决在液相和质谱之间传送1ml/min 流速水溶液流动相的难题，可使用EI和CI两种离子化源。在最初的设计中非常复杂，直到1987 年后的五年内才得到突飞猛进的发展。该接口是将液相色谱的流动相通过一根电阻式加热毛细管进入一个加热的离子室，毛细管内径约0.1mm，比液体直接导入接口的取样孔大很多。毛细管的温度调节到溶剂部分蒸发的程度，产生蒸汽超声喷射，在含有水溶剂的情况下，喷射中含有夹带荷电小液滴的雾状物。由于离子室是加热的，并由前级真空泵预抽真空，当液滴经过离子源时继续蒸发变小，有效地增加了荷电液滴的电场梯度。最终使其成为自由离子而从液滴表面释放出去，通过取样锥内的小孔离开热喷雾离子源。

热喷雾接口的优点是：可以减少进入质谱的溶剂量，对不挥发的分析物分子也可电离，可以接受的溶剂流量大致范围为0.5~2.5ml/min，但不允许有不挥发性缓冲溶液。缺点是：该接口技术的重现性较差，受溶剂成分、取样杆温度及离子源温度的影响；是一种软电离技术，在谱图中只有分子离子峰，碎片非常少；对分析物要求有一定的极性，流动相中要有一定量的水，对热稳定性差的化合物有明显的分解作用。

6 电喷雾离子化技术

电喷雾（ESI）技术作为质谱的一种进样方法起源于20 世纪60 年代末Dole等人的研究，直到1984 年Fenn 实验组对这一技术的研究取得了突破性进展。1985 年，将电喷雾进样与大气压离子源成功连接。1987 年，Bruins 等人发展了空气压辅助电喷雾接口，解决了流量限制问题，随后第一台商业化生产的带有API 源的液-质联用仪问世。ESI 的大发展主要源自于使用电喷雾离子化蛋白质的多电荷离子在四极杆仪器上分析大分子蛋白质，大大拓宽了分析化合物的分子量范围。

ESI 源主要由五部分组成：（1）流动相导入装置；（2）真正的大气压离子化区域，通过大气压离子化产生离子；（3）离子取样孔；（4）大气压到真空的界面；（5）离子光学系统，该区域的离子随后进入质量分析器。在ESI 中，离子的形成是分析物分子在带电液滴的不断收缩过程中喷射出来的，即离子化过程是在液态下完成的。液相色谱的流动相流入离子源，在氮气流下汽化后进入强电场区域，强电场形成的库仑力使小液滴样品离子化，离子表面的液体借助于逆流加热的氮气分子进一步蒸发，使分子离子相互排斥形成微小分子离子颗粒。这些离子可能是单电荷或多电荷，取决于分子中酸性或碱性基团的体积和数量。

电喷雾离子化技术的突出特点是：可以生成高度带电的离子而不发生碎裂，可将质荷比降低到各种不同类型的质量分析器都能检测的程度，通过检测带电状态可计算离子的真实分子量，同时，解析分子离子的同位素峰也可确定带电数和分子量。另外，ESI 可以很方便地与其它分离技术联接，如液相色谱、毛细管电泳等，可方便地纯化样品用于质谱分析。因此在药残、药物代谢、蛋白质分析、分子生物学研究等诸多方面得到广泛的应用。其主要优点是：离子化效率高；离子化模式多，正负离子模式均可以分析；对蛋白质的分析分子量测定范围高达105 以上；对热不稳定化合物能够产生高丰度的分子离子峰；可与大流量的液相联机使用；通过调节离子源电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。

7 大气压化学离子化技术

大气压化学离子化（APCI）技术应用于液-质联用仪是由Horning 等人于20 世纪70 年代初发明的，直到20 世纪80 年代末才真正得到突飞猛进的发展，与ESI 源的发展基本上是同步的。但是APCI 技术不同于传统的化学电离接口，它是借助于电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程，因此也称为放电电离或等离子电离。从液相色谱流出的流动相进入一具有雾化气套管的毛细管，被氮气流雾化，通过加热管时被汽化。在加热管端进行电晕尖端放电，溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态分子碰撞，经过复杂的反应后生成准分子离子。然后经筛选狭缝进入质谱计。整个电离过程是在大气压条件下完成的。

APCI 的优点是：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI 过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3 个数量级；液相色谱-大气压化学电离串联质谱成为精确、细致分析混合物结构信息的有效技术。