5大容易上手的高效液相色谱柱的填装方法大揭秘（一）

目前大多数实验室是购买商品预填装柱来满足分离、分析之需。

液相色谱柱、特别是高效液相色谱柱的填装，需要有较高的技巧和熟练的技能。因此，有人甚至将“装柱”看作是“艺术加技术”。

但是只要掌握了一些基本的规律和方法，任何实验室都可以填装出具有较高柱性能的色谱柱。

在有关色谱基本理论的讨论中可以得知，发生在色谱柱中总的谱带展宽效应与流动相的线速度、粒径以及溶质在流动相中的扩散系数、溶质在固定相中的扩散系数等密切相关。对于给定粒径的填料来说，能否填充成均匀而紧密的柱床，是得到高性能柱子的关键，而采用粒径细且分布均匀的优质填料，则是得到高性能柱子的zui基本保证。

高压匀浆法装填

zui常用的方法是高压匀浆法。将填料悬浮在适宜的匀浆液中制成匀浆，在其尚未沉降之前，很快地以高压泵将其以很高的流速压进柱中，便可制备出填充均匀的柱子。高压匀浆法的设备，如图12-2-9所示。

装柱机的核心是气动放大泵，通常多设计放大率为100，即低、高压柱塞直径比为10:1，面积比为100:1的气动放大系统。若低压端输入1MPa压强的压缩空气（通常可用压缩空气钢瓶供给），则相同的压力会传递至高压端柱塞上，而高压柱塞面积仅为低压端的1/100，因而其输出压强亦提高至100MPa。由于气动放大泵很容易获得高压、高流速的输液，故很适于柱子的填充之需。
   

 在装柱之前，先确定所用的柱型，以确定选用多大的匀浆罐体积。例如，常用的“标准”HPLC柱为φ4.6mm×250mm，其内腔体积约为4.2mL，约需3.5g填料。一般情况下，为保证填充的成功，需适当过量15%-20%为宜。如使用4g填料充填它，选择固 - 液比约为1:10，则匀浆罐体积以4mL为宜。若罐过大，则可在匀浆罐内装入一个以惰性材料（如聚四氟乙烯或不锈钢）制的衬套将其调整至所需体积。

将选用的柱子仔细以乙醇或丙酮清洗干净，并以干净的热风吹干。如柱管内壁污染较重，也可以用表面活性剂及去离子水依次清洗，并以长竹签或塑料棒扎上棉纱或纱布往复抽擦，以除去污垢。但应注意不要伤及内壁表面的光洁度，尤其不能造成轴向的划痕。将清洁的柱管的一端装配上带滤板的柱头，另一端则连接至匀浆罐上。

配制勾浆液是高压匀浆法的重要一环，不同的填料应采用不同的匀浆液。不同的文献和实验室所报道的勾浆液的种类和比例有所不同。例如，填充硅胶正相柱，可以使用1:1 的氯*fang/甲醇；对于C18反相填料，可以使用适宜比例的正己烷4氯*fang混合溶剂。若有四溴乙烷等高密度溶剂，也可以以2:1的高密度溶剂与40%的二氧六环和40%的四氯化碳配成匀浆液。一些实验室中，常以%*! 的四氯化碳1 二氧六环配成匀浆液，也可以填充出性能很好的柱子。称取所需重量的填料，将其置小烧杯中，按其重量的10 倍量（一般也可以按体积计，即10mL的匀浆液中加入1g 重的填料）加入匀浆液。摇动或搅拌均匀后，将其移至超声波浴中，以中强的超声波令填料粒子均匀而稳定地悬浮起来。zui后，再以强超声短时间强化一下。超声处理的时间不宜过长，一般应不超过2-3min，过长则可能造成颗粒的破碎。

将准备好的勾浆液立即倒入匀浆罐中，装满后，将匀浆罐盖好、旋紧，再以针筒抽取一定量的匀浆液，从盖子上的连接孔中插入匀浆罐内部并加注匀浆液至从连接孔中溢出为止。这一操作的目的是排除匀浆罐中的空气泡，空气泡的存在会妨碍向系统中迅速地施加压力。抽出注射针并将罐与气动放大泵的出液管路相连。确认连接正确且牢固后，即可开启放大泵的截门，令贮存于气动放大泵内的顶替液（正相时可以使用氯*fang，反相时可使用甲醇）高速压入罐内。以常见的5μm多孔硅胶填料为例，填装压力为50MPa左右（细孔硅胶可至70MPa）。这里使用的是瞬间升压的方式，也有文献报道使用程序加压。加压时，匀浆液中的填料滞留于柱尾的滤板上而匀浆液则被排除于柱外。开始时，排出的匀浆液因含部分气体，释压后会逸出而使液体浑浊。待全部匀浆液被排出后，因顶替液黏度较少而流速亦稍加大，且排出液有明显的外观上的变化。此时，可以稍稍降低填充压力，例如，降至约35MPa，并维持30-40min，然后，在约30min, 内逐步将压力降至常压。降至常压后，宜静置一段时间，例如30min,，以让柱床内的压力平衡。否则，过早拆卸下已填充的柱子时，会因柱子内部的残余压力而将柱头上的填料挤出往外。拆下已填装好的柱子并装配上带有筛板（滤网）的柱头（注意：一定要将沾在柱头锥套上的填料除净，否则会影响到柱子的密封性），做好标记，即已完成柱子的填装。

在上述填装程序中应该注意的问题是：①高压操作的安全问题。常发生的问题是柱子与匀浆罐连接不牢，造成加压时柱头被高压冲下或柱子从匀浆罐上滑脱。此时，轻则填装失败，材料损失，重则造成人身伤害事故，一定要加以防范。除每次填装前均须仔细确认是否连接正确且牢靠外，zui好还可加上由法兰盘和长螺杆组成的预防脱落装置，以防万一。②通常，先填装的柱床较后填装的柱床紧密。因此，当使用时宜以相反的方向为宜，即让近匀浆罐一端作为使用时流动相的出口，而填装时的出口端则作为流动相的入口。③新柱子使用前应以甲醇冲洗20-30min, 后，再改用流动相平衡。④新柱子宜选适宜的标准样品进行评价并记录，以备存查和比较。

    实验和理论研究均指出，以上述下流式匀浆法难以填装成长柱子，其原因是，随着已填充柱床的增高，对流体的阻力亦逐渐增加，使在一定压力下通过柱床的流速降低，亦即柱床的增长速度变慢，在这一过程中，填料颗粒的沉降亦在进行，导致所填充柱床的紧密性和均匀性降低。为保证达到一定柱效，一次填充的单柱长度不宜过大。有文献指出，使用6mm内径的柱子，5μm粒径填料，适宜的单柱柱长为10-15cm。但是近年来，φ4.6×250mm的预装柱已被认为是标准柱型，在这样的柱子上，多能获得≥80000片/m理论塔板的柱效。
为制取更长的柱子，可以使用上行法（图12-2-10）。曾有报道，使用3μm 填料，以上行法可以制备长达1m 的柱子，且其柱效与短柱子相类似。上行法中使用的匀浆液浓度比下行法要小一些，速度也慢一些，因此所填充的柱床相对较均匀。近年来，由于微柱色谱和毛细管电色谱的发展，需要填微色谱柱乃至毛细管色谱柱，而上行法则可以用作为微柱的填充方法之一。

湿法装填

对于高效柱、特别是现在流行的以3-10μm细柱径填料填装的高效分析柱，则必须使用湿法，即匀浆法装柱。因为，随着粒径的缩小，因静电作用和表面能的加大，粒子间倾向于聚集和“粘结”，若以干法填装，它们会粘附在连接管及柱壁上，也会因强烈的静电作用彼此排斥，因而难以填装出均匀而紧密的柱床。这样，必须改以湿法装填，即将填料悬浮于适宜的液体中消除上述不良作用。但是，在固 - 液系统中仍然存在因重力而引起的沉降现象。粒子沉降的速度V为

式中，g为重力加速度（cm/s² ），d为粒子直径（cm），ρ为粒子密度（g/cm³），ρ_o为液体密度（g/cm³），η为液体的黏度（mPa·s）。从上述公式可知，粒子在液体中的沉降速度，与粒径直径的平方以及液 - 固密度之差成正比，而与液体黏度成反比。据此，湿法填装可以依阻止沉降的思路分成三种：一条思路是设法寻找与硅胶密度相近的溶液，以使（ρ-ρ0）减小而降低沉降速度。第二种方法是增加液体的黏度以阻止粒子的下沉。第三种方法是综合利用前两种方法，尽力减小沉降并尽快地在发生较显著的沉降之前完成装柱操作。