高效毛细管等电聚焦电泳色谱仪分析技术

高效毛细管等电聚焦电泳色谱仪（CIEF）是以载体两性电解质为介质，根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术。

一、载体两性电解质应具备的条件：

        载体两性电解质是两性分子，使其在电泳柱中能达到一个平衡位置。载体两性电解质可作为载体，但两性电解质不能用于等电聚焦。只有载体两性电解质，即具有好的电导和缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。

  1、易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。

  2、在pI处应有良好的电导和相同的电导系数，以保持均匀的电场。

  3、分子量小，易与被分离物分开。

  4、本身紫外吸收低。

  5、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。

二、蛋白质的等电点（pI）：

        蛋白质具有许多可解离的酸性基团（－COOH）和碱性基团（－NH₂）及其它基团，在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正、负离子的数目相等，成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点（pI）。

        蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。组成每一种蛋白质、多肽的氨基酸数目和比例不同，蛋白质的等电点范围很宽，可利用等电点差异分离蛋白质。

        当pH＜pI时，溶质带正净电，向阴极泳动，与电渗方向相同，溶质迁移总速度比电渗速度快。

        当pH＞pI时，溶质带负净电，向阳极泳动，与电渗方向相反，溶质迁移总速度比电渗速度慢。

        当pH = pI时，正负解离相等，净电荷为零，溶质迁移速度和电渗速度相同。

三、载体两性电解质pH梯度的介质：

        一般采用氨基酸和氨基聚合羧酸的缓冲液。

四、载体两性电解质pH梯度的形成：

        CIEF电泳的关键是pH梯度的形成，载体两性电解质pH梯度的介质是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后自然形成pH梯度。

        在没有电场时，载体两性电解质的pH值约是该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质分子都荷电。

        当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有zui低等电点的分子（荷负电zui多）将zui快地向阳极移动，当它达到净电荷为零的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。一些低pI的载体两性电解质（荷负电次多）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到零时才停止。同样，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极和阴极之间到达自己的位置，从而形成pH梯度。

五、工作原理：

        CIEF电泳是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定、连续和线性的pH梯度中进行分离。

        毛细管内充有载体两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀氢氧化钠溶液。当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。利用气压压力将已等电聚焦的样品推动，经过检测器进行检测。

        聚焦过程可用电流检测，当聚焦完毕，无电流通过。蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的区带，可获得非常高的分辨率。不同蛋白质的等电点不同，能在CIEF电泳中聚焦成不同的区带而得以分离。

六、特点：

  1、优点：

（1）具有极高的分辨率，区带清晰且窄，通常可分离等电点差异小于0.01pH单位的两种蛋白质。

（2）可测定蛋白质和多肽的等电点。

  2、缺点：

（1）由于CIEF柱表面覆盖物的不稳定性限制了广泛应用。

（2）需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白质。

七、注意事项：

  1、电渗流在CIEF电泳中不利，应消除或减小。

  2、由于局部高度浓缩，可能会导致蛋白质沉淀阻塞，需要加添加剂如聚乙烯醇（PVA）等对蛋白质pI影响小的非离子表面活性剂。

  3、由于通常所用载体两性电解质在低紫外有吸收，紫外吸收检测通常在较高波长即280nm进行。

八、应用：

        分离对象只限于蛋白质和其它两性分子，常用于同工酶的分离和pI测定，特别适合分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。

        在分离混合多肽物质中应用不多，主要应用于分离不同来源的多肽异构体。

        可用于分离其它方法无法分离的蛋白质，如免疫球蛋白、血红蛋白、血清转铁蛋白和低浓度生物样品等。