志贺氏菌属,荧光定量,PCR检测试剂盒实验操作步骤

名称：志贺氏菌属,荧光定量,PCR检测试剂盒

实验操作步骤
1. DNA提取：取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清；加入50µL DNA提取液，充分混匀后沸水浴5 min，13,000rpm离心5min，取上清液进行检测或保存于-20℃以待检测。
2. 扩增试剂准备（在试剂贮存和准备区完成）
2.1. 从试剂盒中取出PCR反应液，冰盒上融化后混匀。试剂在使用前2000rpm离心20s备用。
2.2. 设需要的PCR反应管管数为N（N = 待检样本数+ 1管阴性对照 +1管阳性对照）。
2.3. 混合液的配制：首先吸取体积为22.6（µL）×N反应液至1.5mL灭菌离心管，再加入Taq DNA聚合酶0.4 （µL）×N，混匀后2000rpm离心20s，然后向N 个0.2mL PCR反应管中分装已加入Taq酶的混合液23µL/每管，盖紧管盖。
2.4. 注意：阴性对照管建议在此区中加入2µL阴性对照样品。
3. 加样（在样品制备区完成）
3.1. 阳性对照取出解冻，使用前2000rpm 离心20s。
3.2. 将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13,000rpm离心5min；向N个PCR管中分别加入待检样本DNA（包括阳性对照）2µL，盖紧管盖，2000rpm离心20s，将PCR反应管转移至核酸扩增区。注意做好样品号标记。
4. PCR扩增（在核酸扩增区完成）
4.1. 上机前应检查各反应管是否盖紧。
4.2. 反应体系设为25µL；荧光信号采集设定在退火温度。对于多通道荧光PCR仪，选择荧光素FAM为信号采集通道。
4.3. PCR循环参数为：*阶段，95℃ 3 min预变性；
第二阶段，[95℃ 10s；60℃ 40s] × 40次循环。
注意：在Roche的LightCycler上使用，变性温度95℃改为93℃，其他不变。
5. 质量控制标准及结果判断
5.1 综合分析仪器给出的各项数据及扩增曲线，设定合理的阈值（Threshold）和基线（Baseline），使仪器给出正确的结果。
5.2 阴性对照CT值应显示为0或≥40.0，阳性对照的CT值应≤30.0，否则视实验失败，需重做。
5.3 检测样品CT≤35.0，结果有效，可直接报告样品阳性。
5.4 检测样品35.040.0，需进行一次重复实验，若CT仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值为零，可报告样品阳性，否则报告样品阴性。
5.5 检测样品CT值为零，报告样本阴性。