口蹄疫聚合酶链反应（PCR）

20世纪90年代初，PCR技术日趋成熟，也渗入到FMD的诊断中。这一技术特异性强，灵敏度高，可检测多种组织样品，检测病毒RNA的PCR方法已经成为FMDV检测方法中的一种，PCR方法具有极高的灵敏度（其理论值为一个病毒粒子的核酸），因为它仅需要极少量的反应模板，而且可以设计多循环PCR反应。由于仅将RNA的目的片段扩增出来所以也具有很好的特异性。PCR检测提供了适合于对应序列的基因物质，提供了较为详细的流行病学信息，为疫源的追踪提供了可靠的理论依据；

近年来随着PCR技术的不断成熟，该技术在检测FMDV方面也有了较大的进展。这种方法不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。RT-PCR和DNA序列分析相结合进行病毒核酸序列分析是zui具权威性的分析毒株异同的方法，应用PCR诊断FMDV，以特殊设计的引物作介导及在反转录酶的作用下再进行PCR扩增，扩增产物用PAGE、琼脂糖电泳或硝酸银染色检查，看扩增出的DNA片段大小与设计是否相符。用此技术诊断FMD的报道始见于1991年，Meyer等根据编码FMDV RNA的多聚酶基因序列（此段为FMDV 7个血清型的高度保守区）设计合成一对引物和探针，经RT-PCR扩增，获得454bp扩增产物，用寡核苷酸探针杂交显示强阳性反应，NcoI酶切证实了预计限制性位点。Laos等在变化的VPl基因序列中选择引物，则可用于鉴别FMDV以色列株。选择使用不同的引物，可以达到诊断和定型FMDV的目的。迄今已有美国、英国、西班牙等国家和地区报道了PCR在FMD诊断中的研究及应用，国内吴时友等就FMDV的PCR检测研究作了报道。朱彩珠等也将此项技术应用于FMD的诊断，可检测出20倍TCID,。（细胞毒）或0．16—0．32倍LD和（组织毒）的病毒量。该法特异性好，检测灵敏度高，可以检测病毒也能直接检测核酸片段，样品可以是水疱液也可以直接用扁桃体、淋巴结、肌肉和蹄、皮肤等组织，这是免疫学方法无法替代的，此方法需要较高的实验设备和熟练的分子生物学实验操作技能，到目前为止，尚未在检疫中推广应用，仅限于专业实验室应用。

选择一对适合于FMDV所有血清型及亚型的引物对是zui首要的问题，所设计的引物需能够将与FMD临床症状相似的小核糖核酸病毒区分开来。引物序列需在基因的高度保守区进行选择，例如：没有结构蛋白RNA聚合酶和5，端不翻译区域。当设计分型引物时，通用型引物需设计在VPl 3’末端的高度保守区，设计出的引物能够成功的将7种血清型的此区域扩增出来。VPl结构蛋白主要反应了FMDV不同血清型的变化，同时对于不同的FMD分离株，可以进行VPl基因编码区的序列分析，建立系统生发树。虽然序列分析是一种非常权威的流行病学调查工具，但是在实施免疫策略的时代，并不是所有的毒株都可以得到相应的序列并进行序列分析。

然而，事实证明对牛进行FMDV检测时RT-PCR检测效果不亚于病毒分离，因为组织内积极的中和反应很可能会影响感染病毒的复制。

巢式PCR作为一项更加灵敏、更特异的检测方法已经被研制成功。但巢式PCR在推广上存在着弊端，原因有两种情况：*种情况，巢式PCR方法很容易出现假阳性，因为PCR操作的实验室环境可能被少量的特异性的核酸片段所污染；第二种情况，由于此技术需要昂贵的试剂和熟练的操作人员，因此它变成了一项复杂的、限制性很强的技术。

FMD的控制主要是依赖前期的诊断，快速、有效的检测方法一直都是所有研究和检测所必需的。生物感受器、实时RT-PCR也已经开始被研究和应用。

M．Scott等为了弥补常规诊断的不足，通过提高PCR方法检测灵敏度和检出率，对实时RT-PCR检测方法作了进一步的研究。实时RT-PCR检测法较普通的RT-PCR方法快捷且减少了污染的可能性。同时ELISA、病毒分离能够与实时RT-PCR检测方法平行应用于FMD的鉴别诊断，在FMDV的检测中实时RT-PCR检测方法起到了有效的辅助作用。