李小波博士等发现光合作用所需的多个候选基因

　　莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一种非常有价值的真核模式生物，被广泛用于与光合作用、呼吸作用、脂类合成、细胞运动（生物鞭毛）、非生物胁迫等生物学过程相关的功能研究（图1）【1】。长期以来，通过同源重组将外源基因插入是敲除莱茵衣藻基因的主要方式，与外源基因的随机插入等方式相比效率极低，而 CRISPR-Cas9，Cpf1 等基因编辑工具在莱茵衣藻中的使用效率还有待提高【1,2】。尽管已经建立了一些突变体库，但覆盖的基因数量非常少，分离其插入位点侧翼序列的效率也很低，因此限制了莱茵衣藻的基因功能研究【1】。

图1. 莱茵衣藻是众多生物学过程研究的模式物种

　　2019年3月18日，普林斯顿大学Martin Jonikas （曾工作于斯坦福卡内基研究所，第一作者现为西湖大学PI李小波研究员）团队联合西湖大学等多家单位的科研人员在Nature Genetics在线发表了题为 A genome-wide algal mutant library and functional screen identifies genes required for eukaryotic photosynthesis 的研究论文。该研究利用多种自动化技术和高通量的测序技术建立了一个大规模莱茵衣藻的突变体库，并通过筛选发现了光合作用所需的300多个候选基因。

　　研究人员利用随机插入的方式将携带有特定序列的DNA片段插入到莱茵衣藻的基因组中，并通过 LEAP-Seq 获取了每个克隆的插入位点信息（更多信息请参见参考文献1和3）。该库包括有6.2万个突变体，覆盖了约83%的编码蛋白质的核基因，该突变体库已经在2016年提前对全世界的研究者公开，在最开始的一年半已经为200多个实验室（数据来源：李小波）提供了2000多个突变体。这些突变体已经被用来研究细胞水平的植物代谢、胁迫反应、表观遗传等多个过程。

　　光合作用是生物圈中最重要的化学反应（1988年诺贝尔化学奖颁奖词）。然而，有证据表明还有很大一部分参与光合作用的基因还未被发现。 在维管植物中进行光合作用所需基因的遗传筛选的主要难点包括：1）光合作用是必须过程；2）筛选通量有限，突变位点发现困难。而该莱茵衣藻突变体库的建成使得大规模分离与光合作用相关的基因成为可能。

　　该研究利用莱茵衣藻可在黑暗条件下能够异养生长的特点，把混合的突变体库在光合自养与异样的条件下的生长状况进行对比，发现了数千个光合自养有缺陷的突变体，通过混池测序鉴定出了303个光合作用所需的候选基因，其中包括65个已知的和238个先前未知的光合作用所需基因（图2）。

图2. 从突变体库中筛选出与光合作用相关的候选基因的功能分类示意图

　　随后，研究人员重点解析了一个新的蛋白磷酸酶（CPL3）的功能。结果表明 cpl3 突变体在光合作用过程中电子传递的速率与野生型相比出现了显著降低，尽管两者的叶绿体形态一致，但是cpl3 突变体中叶绿素 a/b 的比例与野生型的相比出现了明显的下降。通过比较蛋白质组学分析发现，cpl3突变体中所有能检测到的与叶绿体ATP合成酶（ATPC, ATPD, ATPG, AtpA, AtpB, AtpE, and AtpF）相关亚基的表达丰度都出现了显著的降低，此外，PSI（PsaA and PsaB）和PSII（D1, D2, CP43, CP47, PsbE, and PsbH）的一些组成成分的表达丰度也出现了下降（图3）。该结果表明 CPL3 是光合作用光反应所需蛋白复合体的正常积累所必需的。

图3. 光反应蛋白复合体等蛋白质在 cpl3 突变体与 WT 中的相对丰度

　　近年来利用藻类中的进行合成生物学的研究越来越多，适用与能源、营养添加剂、药用天然产物等领域。莱茵衣藻是真核藻类中工具比较全的系统，而且也有研究组（UCSD Steve Mayfield）在试图大规模培养，以用于药用蛋白的生产等。这个突变体库对于合成生物学前期的基因功能发掘具有重要意义。

　　本项研究由六家单位合作完成，包括普林斯顿大学、斯坦福卡内基研究所、 西湖大学、斯坦福大学、加州大学旧金山分校和明尼苏达大学。西湖大学李小波研究员为该论文的第一作者。

　　专家点评

　　杨文强 研究员 （中科院植物所）

　　绿藻与陆地植物在进化上有着紧密的亲缘关系，大约在5亿年前分开。单细胞绿藻由于生长周期短等优点可以被用作植物学研究的模式生物。其中，莱茵衣藻三个基因组（核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组）测序已经完成，容易转化和杂交等优点已经被广泛地用于光合作用、碳浓缩机制、色素代谢、温度胁迫、厌氧与发酵、细胞分裂、鞭毛与疾病、光遗传学等过程的研究。尤其是叶绿体发育和光合作用调控等方面的高度保守性和相似性，是衣藻成为一种炙手可热的模式生物。近年来，衣藻与高等植物共进化方面的研究也逐渐崭露头角。在过去的20 年里，衣藻研究的主要障碍是对于特定的基因，人们很难获取相应的突变体，这就大大限制了从遗传角度展开功能基因组学的研究。基于同源重组的基因敲除等技术在衣藻中成功率较低，而CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1 等基因编辑技术也仅在近年被报道，且效率较低。一个突变位点已知并能长期稳定保存的突变体库将大大提高莱茵衣藻中的反向与正向遗传学研究的效率。

　　李小波博士在Martin Jonikas 团队工作时领导了莱茵衣藻突变体库建立的项目。他们首先开发了高通量的突变体继代技术与中等通量的插入突变定位技术，建立了小规模的试验突变体库（~1900个突变体；Li#, Zhang#, Patena# et al. 2016 Plant Cell）。近期，李小波博士等建立了更高通量、更高准确率的突变定位技术，利用这些技术对20万个衣藻突变体中的13万个进行了成功的突变定位，在去除了一部分基因的冗余突变体后将6万多个突变位点已知的突变体稳定保存下来。插入位点近乎均匀地分布在莱茵衣藻的17条染色体上（见论文图1）。在这个大型突变体库中，他们还对每一个突变体插入了特异的DNA条形码序列，并利用混池测序技术对生物圈中最重要的化学反应-光合作用所需的基因展开了高通量筛选，共获得数千个光合作用有缺陷的突变体，发现了光合作用所需的300多个候选基因。李小波博士在西湖大学成立实验室后，对其中的一个潜在的蛋白磷酸酶突变体进行了初步的机理研究。这些工作近期被发表于Nature Genetics （Li et al. 2019 Nature Genetics）。

　　专家点评

　　范建华 教授 （华东理工大学）

　　莱茵衣藻是真核微藻领域的模式藻株，其细胞结构独特，遗传学背景清晰，目前已成功实现了细胞核、叶绿体和线粒体基因组的遗传转化，是真核微藻中研究最为成熟的表达系统/基因编辑体系。目前已有大量的外源蛋白（如报告基因、药用蛋白、工业酶、抗体、疫苗、细胞因子等）成功实现表达。作为模式生物，莱茵衣藻的核基因组、线粒体和叶绿体基因组的测序工作已全部完成，这为利用莱茵衣藻人工设计外源基因、成功实现表达与调控提供了巨大的方便，现已被认为是最有前途的“绿色细胞工厂”。

　　近年来，真核微藻的合成生物学研究主要集中在莱茵衣藻，利用合成生物学技术改造衣藻可生产木糖醇、倍半萜、霍乱、疟疾疫苗和免疫毒素等化学产品和重组蛋白。相对于原核微藻，真核微藻细胞具有蛋白翻译后修饰途径，对特定蛋白的生物活性不可缺少。然而，微藻合成生物学特别是底盘的优化研究仍处于一个初始阶段，在抗逆元件挖掘解析、光合效率的优化、耐受性底盘的优化、合成产物的细胞器靶向运输以及富集等方面亟待研究。李小波研究员的论文通过构建基因组饱和的莱茵衣藻突变体库，建立高通量的智能筛选方法，首次突破全基因组尺度的微藻底盘光合作用及逆境耐受的功能元件挖掘解析，有望拓展和完善莱茵衣藻的基因组遗传操作平台，并为突破自养型真核绿藻细胞人工设计和生物合成体系的大规模工业化应用奠定基础，具有重要的科学意义和应用价值。

　　参考文献

　　1. Li, X. et al. An indexed, mapped mutant library enables reverse genetics studies of biological processes in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell 28, 367–387 (2016).

　　2. Slaninová, M. et al. Is it possible to improve homologous recombination in Chlamydomonas reinhardtii Biologia 63: 941–946 (2008).

　　3. Zhang, R. et al. High-throughput genotyping of green algal mutants reveals random distribution of mutagenic insertion sites and endonucleolytic cleavage of transforming DNA. Plant Cell 26, 1398–1409 (2014).