病理学中的显色原位杂交和FISH实验

Tris-EDTA 溶液PBSDigest-All 3福尔马林磷酸缓冲液二甲苯乙醇生物素和地高辛标记的DNA探针CAS-block (Zymed Laboratories)链霉亲和素

石蜡切片烤箱微波炉染色缸热循环仪潮湿烤箱

一、杂交前玻片处理

1.于 60°C 烤箱中烤片过夜。

2.在二甲苯中脱蜡 3 次，每次 15 min。

3.100% 乙醇脱水 3 次，每次 2 min，空气干燥。

4.将盛有 Tris-EDTA 的塑料染色缸或其他用于微波炉盛水用的塑料容器，于微波炉中加热至 199°F。

5.将玻片放人 Tris-EDTA 中，并继续于微波炉中 199°F 加热 15 min。

6.取出玻片，放在 PBS 中。

7.吸去玻片上多余的 PBS，然后放入 37°C 潮湿的玻片盒内（或其他潮湿的孵育盒内）。

8.在玻片上加 100~500uL Digest-All3, 依据组织类型和固定情况消化处理 10~30 min(见注释 1)。

9.将玻片放入 PBS 中终止消化。

10.在 10% 福尔马林缓冲液中固定 lmin，然后将玻片放在盛有 40 mLPBS 的染色缸中轻洗一下，去除福尔马林。

11.室温下，于 70%、85% 和 100% 乙醇中各 2 min 脱水，空气干燥。

二、变性和杂交

1.将足够的探针，如 10uL 加到组织切片上，适于 22 mmX22 mm 的盖玻片范围大小。

2.将盖玻片盖到切片上，用橡皮泥封边。

3.将玻片放到热循环仪的玻片槽内，于 94°C 变性玻片 3 min。

4.将玻片转移到玻片盒内，将其放到潮湿的孵育箱中，于 37°C 过夜。

三、杂交后洗脱

1.依照每个染色缸内玻片的数量设置水浴的温度，1 张玻片为 73°C，2 张 74°C，3 张 75°C，4 张 76°C。

2.将盛有 40 mL0.5XSSC 的染色缸放于水浴中，使缸内温度与水浴温度平衡。应在染色缸和内容物的温度不低于室温时，将其放入水浴。否则染色缸可能炸裂。用温度计确定最终温度。

3.从玻片上去除橡皮泥和盖玻片。

4.在 0.5XSSC 中洗脱玻片 5 min。

5.将玻片转移到室温下盛有 40 mL 的 PBS/T 染色缸中。

四、检测

FISH

1.去除玻片上多余的 PBS/T，将其放在潮湿的塑料玻片盒内。

2.将 100~500uL CAS-bl 〇 Ck 抗体稀释液加到切片上，室温孵育 lOmin。

3.轻轻蘸去 CAS-block，然后加 100~500uL 连接荧光的检测试剂，如 1:500 稀释的链霉亲和素-Alexa594 和抗地高辛-焚光素。室温孵育 30 min。

4.室温下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脱 3 次，每次 2 min。

5.用 DAPI 封片介质复染玻片。

CISH

1.去除玻片上多余的 PBS/T，然后将其放到潮湿的塑料玻片盒中。

2.在切片上加 CAS-block，室温下孵育 lOmin。

3.轻轻蘸去 CAS-block，加 HRP-链霉亲和素，室温下孵育 30 min。

4.室温下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脱 3 次，每次 2 min。

5.依照操作说明书指南制备 DAB 底物，去除玻片上多余的 PBS/T，用 DAB 孵育玻片 15 min。

6.室温下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脱 3 次，每次 2 min。

7.去除玻片上多余的 PBS/T，加抗地髙辛-荧光素（见注释 2)，室温下孵育 30 min.

8.室温下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脱 3 次，每次 2 min。

9.去除玻片上多余的 PBS/T，加碱性磷酸酶抗荧光素，室温下孵育 30 min。

10.室温下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脱 3 次，每次 2 min。

11.依照操作说明书指南制备快红底物，用 0.45pm 滤膜过滤。

12.流去/轻轻蘸去玻片上的 PBS/T，然后将快红底物加到切片上，孵育 30 min，期间换两次快红底物，每隔 IOmin 换一次，即把玻片上的底物轻轻蘸去，再加上新过滤的底物。

13.室温下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脱。

14.用苏木素复染玻片，请小心不要过度染色（见注释 3)。Gill’sformula(非有机溶剂—见注释 4) 应与快红联合使用。

15.流水冲洗玻片数分钟，不要用柠檬酸氨增强苏木素的蓝色。

16.在 50~75°C 烤箱或水浴中加热甘油凝胶，滴一滴于切片上（不用有机溶剂），盖上盖玻片。轻压盖玻片以去除多余的甘油凝胶，如果甘油凝胶已经凝固，可以在热板（37~45°C) 上加热玻片。

注释

1.残余的细胞外和细胞内蛋白质可引起淡的红-橙色之间的自发荧光，使 FISH 信号减弱，尤其当真的探针信号较弱时。通过增加石蜡切片的酶消化时间可以减小自发荧光。组织切片消化得不充分也将妨碍探针进入靶染色体区域（使「真」信号较弱），并且探针与非染色体细胞成分非特异的结合。因此，一般来讲，如果细胞形态仍非常好（基于 DAPI 复染）并且细胞有散在的小的非特异性信号的话，消化时间应增加。适当杂交的石蜡切片应具有保存完好的细胞形态 (尽管不必非常好）、非常明显的探针信号以及无非特异性信号。

2.此处的 CISH 检测程序是通过后续的用荧光素抗地高辛和碱性磷酸酶抗荧光素孵育实现地高辛标记探针的扩增。然而，地高辛标记的探针也可以不用扩增步骤来检测，此时则用碱性磷酸酶抗地高辛代替荧光素抗地高辛。

3.与双色 FISH 的荧光素和罗丹明荧光相比，双色 CISH 的不同颜色间的区别不明显，当探针信号非常小的时候，辨别 DAB 与快红尤为困难。然而，常常可以通过上下调节切片的焦距来辨别染色。在准确的聚焦点上，快红或多或少有折射，红色很明显。苏木素复染以能够看见细胞核的最小量为宜，这也是很重要的。因此，苏木素应该仅是浅蓝色。否则，苏木素将遮盖与快红颜色相区别的 DAB。

4.快红染色后不能用有机溶剂封盖玻片。尽管我们发现 CISH 玻片可以在室温下存放约数月，但 FISH 和 CISH 玻片常规上还是保存于 4°C。存放时 FISH 信号将部分淬灭，而 CISH 信号大约可以稳定 2 年。

5.可以结合 CISH 和免疫组化染色，可以对双色 CISH 程序稍做修改 (图 1)。这种情况下，可分别通过单色 CISH 和免疫组化检测一种染色体靶和一种蛋白质