基因置换实验——构建融合蛋白

菌株BY4741质粒PDB118

磷酸盐缓冲液

YPD 平板YPD 液体培养基血球计数板SC-his平板

YPD 平板 第 1 天

将菌株 7-3 在 YPD 平板上划单克隆，30°C 下培养两天。

第 3 天

挑取单克隆，在 5 mlYPD 液体培养基中培养，30°C 过夜。

第 4 天

使用血球计数板测定细胞密度（附录 G)。将细胞稀释至 5X106 个/ml，按照「技术和方案 1，酵母的高效转化」进行高效转化。两个 DNA 样品将被用作转化。

GFP 标记的 PCR 产物：lOOpl，含约 8pgPCR 产物。PCR 反应利用「技术和方案 14,PCR 介导基因破坏法」，使用质粒 PFA6a_GFP(S65T) 作模板、引物 NDCTAG1 和 NDCTAG2 进行。所得 DNA 将在 4 个单独的转化实验中使用。

降解决定子标签的 BgZII 酶切的 PDB118: 约 lpg 的 pDB118 质粒经 n 酶切。

这些 DNA 在一次转化中使用。确定在转化中含有一个阴性对照（不含 DNA)。

将 GFP 标签的转化菌涂于 SC-his 平板上。将降解决定子标签的转化菌涂于含有 lOOpmol/LCuS04 的 HC-lira 平板上。23°C 培养 5 天。

GFP 转化

第 7 天

在单独的 SC-hls 平板上将转化子（10 个）重新克隆。

第 10 天

从每个转化子中挑取一个菌落，按「技术和方案 15, 酵母菌落 PCR」作 GFP 融合鉴定。在反应中用四个不同的引物—引物 1?4。确定包括有来自菌株 7-3 细胞的作为对照。

电泳分离 DNA，鉴定 GFP 融合。在 YPD 液体培养基中过夜培养 5 ml 细胞。

第 11 天

取 0.2 ml 新鲜的过夜培养液于 5 mlYPD 培养基中。30°C 培养细胞 4 h，获得重新进入细胞周期的细胞。按「技术和方案 12, 酵母免疫荧光法」用甲醛固定细胞，但是将固定时间减少至 15 min。细胞染色，用 DAPI 标记 DNA，用 CY3 共轭二抗以抗微管蛋白染色法显示微管。

降解决定子转化

第 9 天

将转化子平板影印到 HC-ura 和含 100|umol/LCuS04 的 HC-ura 平板上。HC-ura 平板于 37°C 下培养，而含 lOO^mol/LCuS04 的 HC-ura 平板于 23°C 下培养。

第 10 天

统计 37°C 下培养的平板，鉴定 5 个温度敏感型菌落。在 1 个含 100pmol/L CiiS04 的 HC-um 平板上复制 4 个候选菌落，于 23°C 下培养。

第 14 天

从每个转化子中挑取一个菌落，按「技术和方案 15, 酵母菌落 PCR」作降解决定子融合鉴定。在反应中使用引物 A 和 B。确定包括有来自菌株 7-3 的细胞作为对照。电泳分离 DNA，鉴定一个含有降解决定子融合的菌落。在含 10(VmOl/LCUSO4 的 HClIra 培养基中过夜培养 5r^l 细胞。

第 15 天

取 0.2 ml 新鲜的过夜培养液于 5 ml 含 lOO/amol/LCuS04 的 HC-ura 培养基中。

23°C 培养细胞 6 h，获得重新进人细胞周期的细胞。取出 2.5 ml 细胞，离心后用无菌水清洗 2 次。清洗后的细胞于 HC-um 培养基中在 37°C 培养 4 h。将剩余细胞培养物放人 23°C，培养 4 h。按「技术和方案 12, 酵母免疫荧光法」用甲醛固定上述两种方法处理的培养物细胞，但是将固定时间减少至 15 min。用 0.lmd/L 磷酸钾缓冲液（pH7.5) 清洗细胞两次。用 lmlO.lmol/L 磷酸钾缓冲液（pH7.5) 重悬细胞于微离心管中，放置在冰箱中过夜。

第 16 天

按「技术和方案 12, 酵母免疫荧光法」，从程序 4 开始，对细胞染色，用 DAH 标记 DNA，用 CY3 共轭二抗以抗微管蛋白染色法显示微管。