一、材料 1. 标本 人单核细胞系U937,细胞密度2×108/L,分对照组(N)、处理Ⅰ组(T1)、处理Ⅱ组(T 2),N用1640培养基及10%胎牛血清培养,T1用IFN-γ104U/L LPS 1 μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0 μg/L分别刺激7 h。
二、 总RNA的制备 1. 按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA,以 RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的 DNA经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性,并以紫外分光光度计检测其纯度。 三、 mRNA差异显示 1. 逆转录反应 选择锚定引物[T7(dT12)AP(anchored prime rs,AP)],序列为5'ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3',其中 M=A/G/C。N=A /G/C/T],以总RNA为模板进行逆转录反应,每管反应体系如下:总RNA l.0μg,AP 4 pmol ,70℃ 5 min,加入50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,10mmol /L DTT,25μmol/L,dNTPmix(1∶1∶1∶1),SuperScriptⅡ 60 Units,总反应体系20 μl ,42℃ 5 min,50℃ 50 min,70℃ 15 min。 2. 荧光标记差异显示PCR 选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物[TMR-T7(dT12)AP],随机引物(5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'),以逆转录产物为模板,进行PCR反应。反应体系包括:20 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),50 mmol/L KCl,3.75 mmol/L MgCl2,逆转录产物3.0 μl,50 μmol/L dNTP mix(1∶1∶1),0.35 μmol/L 5'-随机引物,0.35 μmol/L 3-锚定引物,Ampli Taq 0.5 Units,总反应体系10 μl。反应步骤如下:95℃ 2 min;94℃ 15 s,50℃ 30 s,72℃ 2 min,4个循环; 94℃ 15 s,60℃ 30 s,72℃ 2 min,30个循环;72℃延伸7 min。 3. 分离差异显示片段 配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶,胶厚0.25 mm,大小61×33 cm。将PCR产物加4.0 μl上样缓冲液,95℃变性后上样。3 000 V、100 W 、55℃电泳4.5 h。干胶后置于Genomyx SC扫描,用系统所带的AcquireSC program软件分 析处理扫描结果。 4. 回收差异条带 用AcquireSC软件将差异条带定位,用一次性手术刀片切割下所需条带,置于30 μl去离子水中,37℃水浴30-60 min,备用。 5. 差异条带的再扩增 以经上述处理的回收条带为模板,T7启动子22-mer(5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’)、反M13(-48)24-mer(5'AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3')为引物,进行再扩增反应:模板2.0 μl,20 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,20 μmol/L dNTP mix(1∶1∶1∶1),0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r、AmpliTaq 1.0 U nits,总反应体系20 μl。反应条件同差异显示PCR。 收起 |