一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：
1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！
4. 所有成分加完后，离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。
参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。
3. 仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：
A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。
B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。
C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。
D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。
E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备
F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。
G. 反应体系的设置：
A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。
需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。
设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！
Real-time qPCR数据分析
1. Real-time qPCR常见参数
基线（baseline）
通常是3-15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值（threshold）
自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。
Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。
2.影响Ct值的关键因素
模板浓度
模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。
反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。
PCR反应的效率
PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。
3. 如何评估实时定量PCR反应的效果
PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。
常见问题
1. 无Ct值出现
检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。
模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2. Ct值出现过晚（Ct>38）
扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。
3. 标准曲线线性关系不佳
加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。
标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。
模板中存在抑制物，或模板浓度过高
4. 负对照有信号
引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
5. 溶解曲线不止一个主峰
引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。
模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
6. 扩增效率低
反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？
判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性
如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。
8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？
参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)
模板的浓度太高或者降解
荧光染料的降解
荧光定量PCR问题汇总
1. 定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？
按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。
开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。
关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？
定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：
3. 为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？
当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。
碎片整理的方法如下：
· 在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(My computer)。
· 在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。
· 在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。
· 单击碎片整理(Defragment)。
· 当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。
· 在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。
· 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。
4. 何时执行windows service pack更新？
不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。新版本的Microsoft Windows操作系统有可能与SDS 软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装service pack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS 软件提供的版本说明，避免兼容性问题。