一、试剂配制 1. STE(25%蔗糖 10 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 1 mmol/L EDTA) 蔗糖 250 g 1 mol/L Tris.HCL 10 ml 0.5 mol/L EDTA 2 ml,加水至1 000 ml 115℃,20 min高压灭菌 2. 1mol/L MgCl2
取 MgCl2 203.30 g,加水至1 000 ml 3. Tris-HCL pH8.5 取Tris 121.14 g 用HCL调pH至8.5,加水至1 000 ml (12 mol/L HCL约30 ml) 4. 0.5 mol/L EDTA pH8.5 乙二氨四乙酸二钠 186.12 g NaOH 20 g,加水至1 000 ml 121℃,20 min高压灭菌 二、操作步骤 1. 称取菌体重量,按5~10 ml/g菌体加入STE溶液,搅拌至菌体完全悬浮。 2. 按0.5~1 mg/g菌体加入用STE溶液新鲜配制的溶菌酶溶液,用玻璃棒用力搅匀后于4℃环境中放置20 min。此时菌液呈粘稠状。 3. 按10 mg/g菌体加入用STE溶液新鲜配制的脱氧胆酸钠(DOC)溶液,用力搅匀。 4. 加入5~10 ml 1 mol/L MgCl2溶液,搅匀后加入约40 μl Dnase I(25 mg/ml)充分搅拌至菌液变稀。 5. 15 000 rpm,4℃离心30 min。 6. 取离心上清,精确量取其体积,测定蛋白质浓度,倒入置于冰浴的烧杯中,边搅拌边缓慢加入固体硫酸铵使其达到50%饱和度。待固体硫酸铵安全溶解后,静置于0℃环境中30 min。 7. 离心,15 000 rpm,4℃,30 min。取离心上清,量其体积,测定蛋白浓度。 8. 将离心上清装入透析袋,4℃搅拌在pH8.5 20 mmol/L Tris-Hcl,1 mmol/L EDTA溶液中透析。 加入硫酸铵不论是固体硫酸铵,还是加入饱和硫酸铵溶液,加入时应边加入边搅拌,特别注意① 加入硫酸铵要慢,因为太快会引起蛋白质发生共沉淀,加入固体硫酸铵时事先要将硫酸铵研磨成粉末,加入饱和硫酸铵溶液时要一滴一滴地加入;② 搅拌要慢,搅拌剧烈,蛋白质溶液容易起泡沫,由于表面张力效应会引起蛋白质变性。 展开 |