反相高效液相色谱2

发布时间：2019-03-28 21:40 原文链接：反相高效液相色谱2

方案2 填充 RP-HPLC 毛细管微柱

试剂、试剂盒	甲醇 n-丙醇反相硅胶 TFA 乙腈溶剂体系
仪器、耗材	水浴超声波仪色谱加样器层析柱玻璃料末端接口环氧树脂流动池正向光学扫描检测器加热枪加样器液相色谱柱填充泵微柱聚丙烯离心管聚硅酸盐管蓝宝石切刀信号数据收集装置硅胶隔膜 Teflon接头 UV检测器
实验步骤	一、毛细管液相色谱系统的构造下面所用的溶剂传送系统（见图 5.10，AHewlett-Packard HP1090M 液相色谱仪）被用作「辅助（slave)」泵来形成微梯度。二、流体的形成 1.为使通过毛细管柱的流速精确到0.05~20ul/min，并能形成可重复的梯度，可以安装一个预加样分流器（l/16in[1.59 mm] 的 T 形管），引导 95% 以上的溶液通过一个长约为 1OOcm(内径 0.1OmmX 外径 0.26 mm) 的溶合桂胶管流人废液池。 2.直接将毛细管柱连接到带有0.2~1.Oul 内置样品转子的 Rheodyne7520 型加样器或装有0.5~50ul 加样环的 8125 型加样器上。 3.将层析柱的流速精确设置到 0.4~4ul/min 可通过调节熔合硅胶管到废液池的长度或改变栗的流速（100~500ul/min) 来完成。对于这种分流的方法，定期（如每天）监控层析柱的实际流速是很重要的。可以通过在出口处安装一个 10ul 的色谱注射器，对层析柱中液体的弯月面的推进进行精确计时。有关该系统构造中所提到的各种部件及其供货商的详细情况在「2.1 材料」中列出。三、UV 检测器 1.采用 ThemoGalactic/SpectraPhysics 正向光学扫描检测器，以 214nm 吸收值来检测毛细管 HPLC 系统的洗脱情况，该检测器装有一 U 形纵向毛细管流动池（路径长度 6 mm，容积约 26.5 ml)。 2.Spectra Focus 软件传输到个人电脑上，或者同时用多波长模式（195~340 mm，5 mm 间隔）来记录。 3.对于毛细管液相色谱/质谱仪（LC/MS) 联用，用一根 50 cm 长的熔合硅管 (内径 0.05 mm X 外径 0.19 mm) 将 UV 检测器直接与电喷雾入口连接起来。该管替代了标准不锈钢电喷雾针，可一直延伸到喷射针的顶端。 4.对于纳流（nanoflow) 毛细管 HPLC, 纳流端直接与出口相连。四、毛细管柱的构造大量的文献已介绍了构成微柱的多种物质，如 Teflon 管（Ishii，etal，1977)、玻璃不锈钢（Chervet，et al，1989) 以及有聚酰亚胺外壳的溶合桂管（Yang,1982)。我们一般采用后者来制备微柱。与上面所提到的其他材料相比，具有聚酰亚胺外壳的熔合硅管具有许多显著的优点（见表 5.8)，如具有灵活性、易于处理和可通透性，且有商品化的各种不同内径和外径的型号，其价格相对低廉。下面以 250 mmX0.20 mm 内径的层析柱为例，分步介绍0.1~0.32 mm 内径熔合硅微柱的组装过程。 1.切两段不同长度的聚酰亚胺熔合硅管，其中一段长为 250 mm(内径 0.200 mm，外径0.340 mm) 作为柱体，另一段长为 20.0 mm(内径 0.050 mm X 外径 0.190 mm) 作为层析柱的出口管。注意：在填充层析柱的过程中，要戴防护眼镜，并遵循推荐使用的安全程序。（1）用悬浆填充法将色谱支持物填充到薄壁毛细管的过程中，毛细管因受到高压（约 40MPa) 而易于折断。例如，在本实验中，内径0.32 mmX 外径 0.540 mm 和内径 0.200 mmX 外径 0.340 mm 的熔合硅管可耐受高达 45MPa 的局压，而内径 0.320 mmX 外径 0?450 mm 的管子在同样的压力下却容易折断，其填充压不得超过 5MPa。最后，还必须注意使用厚壁的熔、合硅管，因其可以以较高的压力填充，从而能够使层析柱获得良好的工作效率。（2）为避免毛细管末端参差不齐，可以用蓝宝石刀来代替较为普通的玻璃刀。末端参差不齐的管子将会导致玻璃料定位不精确。（3）用 Teflon 管来连接熔合硅管（见图 5.10)。由于来自不同厂家的熔合硅管的外径有细微的差别，通常加固这些接头以达到紧密连接。一般可以方便地采用两个钳子来夹紧内径稍大的 Teflon 管。 2.用一较短（50 mm) 的溶合桂管（内径 0.32 mm 或 0.20 mmX 外径 0.45 mm 或 0.34 mm) 作为圆盘切割器，从一大张 PVDF 膜上切下 PVDF 封管膜片，即通过将 PVDF 膜置于硅胶隔膜上，然后在 PVDF 膜上打孔而制成 PVDF 封管膜片。一般用柱的出口管将 PVDF 封管膜片插入到微柱中，约 1Omm 深。另外，有很多有孔膜物质可用作微柱的封管膜片，包括 Zitex 膜（Davis 和 Lee，1 卯 2)、玻璃纤维滤纸（Davis 和 Lee，1992)、亲水性的聚偏二氟乙稀（PVDF) 膜（Moritz 和 Simpson,1992a，1992b)。在本实验中，采用了 0.45um 的多孔性亲水 PVDF 膜。 3.永久固定微柱体和微柱出口管：在两管接头处滴一小滴预处理过的环氧树脂。环氧树脂已部分聚合或用加热枪处理使其塑化，以增加其黏度，因此不会渗人毛细管造成阻塞。五、层析柱的填充当将 PVDF 封管膜片固定好，熔合硅毛细管柱制备完成，便可以开始用悬浆填充法的程序来填充微柱。 1.用带有标准的内置液相色谱柱（0.5 mm 内径的流通孔以及 l/4in(0.635 cm) 柱末端接口）的中空 50 mmX2 mm 内径的玻璃衬里不镑钢管制备一个悬浆槽。 2.用 vespel 材料/石墨和手拧螺母将熔合硅微柱与标准的 1/4111 液相色谱末端接口连接起来。 3.在 I.5 ml 聚丙婦管中将反相桂胶浆在 n—丙醇（Aomg/zoojul) 中超声处理 15 min。 4.在填充层析柱之前，先按标准色谱柱填充法，用填充溶剂（n_丙醇）在高压下（40MPa) 填充毛细管柱。这一步使用填充溶剂预填充微柱，可检测系统的密封性。 5.从层析柱填充机和微柱上将悬桨槽卸下，倒空，再复位，装入备好的 150ul 的反相硅胶浆混合物。 6.在恒压 40MPa 下，装柱 20 min; 在相同压力下再用 50% 甲醇溶液固定 20 min，然后就可以给层析柱减压了。 7.小心地拆下层析柱，将其顶端和底端都插入硅胶隔膜中，以使之密封。展开

试剂、试剂盒

甲醇 n-丙醇反相硅胶 TFA 乙腈溶剂体系

仪器、耗材

水浴超声波仪色谱加样器层析柱玻璃料末端接口环氧树脂流动池正向光学扫描检测器加热枪加样器液相色谱柱填充泵微柱聚丙烯离心管聚硅酸盐管蓝宝石切刀信号数据收集装置硅胶隔膜 Teflon接头 UV检测器

实验步骤

一、毛细管液相色谱系统的构造

下面所用的溶剂传送系统（见图 5.10，AHewlett-Packard HP1090M 液相色谱仪）被用作「辅助（slave)」泵来形成微梯度。

二、流体的形成

1.为使通过毛细管柱的流速精确到0.05~20ul/min，并能形成可重复的梯度，可以安装一个预加样分流器（l/16in[1.59 mm] 的 T 形管），引导 95% 以上的溶液通过一个长约为 1OOcm(内径 0.1OmmX 外径 0.26 mm) 的溶合桂胶管流人废液池。

2.直接将毛细管柱连接到带有0.2~1.Oul 内置样品转子的 Rheodyne7520 型加样器或装有0.5~50ul 加样环的 8125 型加样器上。

3.将层析柱的流速精确设置到 0.4~4ul/min 可通过调节熔合硅胶管到废液池的长度或改变栗的流速（100~500ul/min) 来完成。

对于这种分流的方法，定期（如每天）监控层析柱的实际流速是很重要的。可以通过在出口处安装一个 10ul 的色谱注射器，对层析柱中液体的弯月面的推进进行精确计时。有关该系统构造中所提到的各种部件及其供货商的详细情况在「2.1 材料」中列出。

三、UV 检测器

1.采用 ThemoGalactic/SpectraPhysics 正向光学扫描检测器，以 214nm 吸收值来检测毛细管 HPLC 系统的洗脱情况，该检测器装有一 U 形纵向毛细管流动池（路径长度 6 mm，容积约 26.5 ml)。

2.Spectra Focus 软件传输到个人电脑上，或者同时用多波长模式（195~340 mm，5 mm 间隔）来记录。

3.对于毛细管液相色谱/质谱仪（LC/MS) 联用，用一根 50 cm 长的熔合硅管 (内径 0.05 mm X 外径 0.19 mm) 将 UV 检测器直接与电喷雾入口连接起来。

该管替代了标准不锈钢电喷雾针，可一直延伸到喷射针的顶端。

4.对于纳流（nanoflow) 毛细管 HPLC, 纳流端直接与出口相连。

四、毛细管柱的构造

大量的文献已介绍了构成微柱的多种物质，如 Teflon 管（Ishii，etal，1977)、玻璃不锈钢（Chervet，et al，1989) 以及有聚酰亚胺外壳的溶合桂管（Yang,1982)。我们一般采用后者来制备微柱。与上面所提到的其他材料相比，具有聚酰亚胺外壳的熔合硅管具有许多显著的优点（见表 5.8)，如具有灵活性、易于处理和可通透性，且有商品化的各种不同内径和外径的型号，其价格相对低廉。

下面以 250 mmX0.20 mm 内径的层析柱为例，分步介绍0.1~0.32 mm 内径熔合硅微柱的组装过程。

1.切两段不同长度的聚酰亚胺熔合硅管，其中一段长为 250 mm(内径 0.200 mm，外径0.340 mm) 作为柱体，另一段长为 20.0 mm(内径 0.050 mm X 外径 0.190 mm) 作为层析柱的出口管。

注意：在填充层析柱的过程中，要戴防护眼镜，并遵循推荐使用的安全程序。

（1）用悬浆填充法将色谱支持物填充到薄壁毛细管的过程中，毛细管因受到高压（约 40MPa) 而易于折断。例如，在本实验中，内径0.32 mmX 外径 0.540 mm 和内径 0.200 mmX 外径 0.340 mm 的熔合硅管可耐受高达 45MPa 的局压，而内径 0.320 mmX 外径 0?450 mm 的管子在同样的压力下却容易折断，其填充压不得超过 5MPa。最后，还必须注意使用厚壁的熔、合硅管，因其可以以较高的压力填充，从而能够使层析柱获得良好的工作效率。

（2）为避免毛细管末端参差不齐，可以用蓝宝石刀来代替较为普通的玻璃刀。末端参差不齐的管子将会导致玻璃料定位不精确。

（3）用 Teflon 管来连接熔合硅管（见图 5.10)。由于来自不同厂家的熔合硅管的外径有细微的差别，通常加固这些接头以达到紧密连接。一般可以方便地采用两个钳子来夹紧内径稍大的 Teflon 管。

2.用一较短（50 mm) 的溶合桂管（内径 0.32 mm 或 0.20 mmX 外径 0.45 mm 或 0.34 mm) 作为圆盘切割器，从一大张 PVDF 膜上切下 PVDF 封管膜片，即通过将 PVDF 膜置于硅胶隔膜上，然后在 PVDF 膜上打孔而制成 PVDF 封管膜片。一般用柱的出口管将 PVDF 封管膜片插入到微柱中，约 1Omm 深。

另外，有很多有孔膜物质可用作微柱的封管膜片，包括 Zitex 膜（Davis 和 Lee，1 卯 2)、玻璃纤维滤纸（Davis 和 Lee，1992)、亲水性的聚偏二氟乙稀（PVDF) 膜（Moritz 和 Simpson,1992a，1992b)。在本实验中，采用了 0.45um 的多孔性亲水 PVDF 膜。

3.永久固定微柱体和微柱出口管：在两管接头处滴一小滴预处理过的环氧树脂。

环氧树脂已部分聚合或用加热枪处理使其塑化，以增加其黏度，因此不会渗人毛细管造成阻塞。