一、材料
1. 肿瘤条件培养基制备
（1）取C3H小鼠的S-180 实体肉瘤组织；
（2）胰蛋白酶消化，Dulbecco改良Eagle氏培养液15 ml（含10 %小牛血清），接种到T-75 Falcon产培养瓶中培养；
（3）在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含10 %小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获多量条件培养基；
（4）4000 转/分，离心后，再通过0.22 μm微孔滤膜滤过，-20 ℃冻存备用（临用前融解）。
2. 凝胶底层制备
（1）取60 mm Falcon产培养皿，加1 %Difco产明胶（用不含钙和镁的Hanks液配制），铺盖瓶底，形成薄层；
（2）置4 ℃过夜；用前再用不许培养液冲洗一次。
二、初代培养
（1）取材
取新鲜牛肾上腺数个，先用Hanks液洗除血污；
（2）剥除被膜，分离出皮质，切成1 立方毫米小块，加0.5 %胶原酶室温中消化1 小时；每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分；
（3）通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段；
（4）650 rpm，4 ℃，离心7 分钟后，弃掉上清胶原酶；
（5）沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心，共两次；
（6）末次沉淀物仍用含10 %小牛血清的Dulbecco改良Eagle 氏培养液重悬后，稍吹打；
（7）接种入铺有明胶底层的培养皿中，37 ℃培养；在培养头1~3 小时中，毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮；
（8）趁此时，吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液；每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1~4 个内皮细胞，以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续2~5 天。
三、毛细血管内皮细胞分离培养
毛细血管细胞初代培养细胞往往杂有其它非内皮细胞成分，此时需进一步纯化。原理与培养肿瘤细胞时排除成纤维细胞类似，可采用机械刮除法。但刮除其它细胞后，剩余毛细血管内皮细胞岛有时数量很少，此时细胞很给生长增殖，需用特殊饲细胞法等才易成功。
（1）初代培养2~3 天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起；
（2）镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除；此操作用细胞解剖器或用手操做均可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长（15~20 分钟）；圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除；
（3）用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞；
（4）剩余内皮细胞岛如小（5~20 个细胞）而少时，生长增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入3T3 等饲细胞；饲细胞接种量为4000 细胞/cm3；
（5）当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基；
（6）接种入明胶底物皿中继续培养（饲细胞死亡命被淘汰），细胞增殖生长汇合后，按1：5 传代。
展开 | 