基本方案通过蔗糖梯度浮选 法 制备 去 污剂 抗 性的 膜 并 通 过免 疫 印 迹 对蛋 白质进行分析材 料细胞，贴壁或非贴壁 N E /P 缓冲液，单独或包含以下一种或多种组分： 1 % 、 2 % 或 5 % (W V ) TritonX-IOO 0.lmol/L 碳酸钠， pHll 5 % 、 3 5 % 或 8 0 % (m /V ) 蔗糖 60m m o l /L 辛基葡糖苷 T N E 缓冲液 去污剂相容的蛋白质检测试剂盒（如 Bio-Rad) 2 X 或 6 X S D S /样品缓冲液 丙 酮（可选），冰冷的 乙 醚（可选） I O c m 的 组 织 培 养 皿（用于贴壁细胞） 22 G 针头 I m l 和 5m l 的注射器 S W 4 1 转子和超速离心管（B e c k m a n ) 对于贴壁细胞，无需进行比较的细胞系 la. 将细胞铺于 2 个 I O c m 组织培养皿中，生长至细胞汇合。对 于 D R M 脂 质 分 析（见辅助方案3)，则接种细胞至5 个 培 养 皿 或 1 0 个培养皿以定量磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或含量稀少的神经节苷脂。 2a. 用 I m l 含 有 1 % 或 2 % Triton X -100 的 T N E / P 缓冲液置冰上裂解细胞20 min。如果有必要，在裂解缓冲液中加入0. lmol/L 碳酸钠， p H l l ，以便更好地定量D R M 脂类得率，提 高 D R M 脂质得率，或减少外周或细胞骨架蛋白与D R M 的结合。在分析 D R M 中的酶活性时，不能使用碳酸盐。 3a. 用细胞刮或橡皮刮将培养皿细胞裂解物刮下来，收于管中。 4a. 如果溶解缓冲液含有碳酸盐，将裂解液通过带 22 G 针 头 的 5m l 注 射 器 1 0 次（保持裂解产物低温）用于剪切 D N A ，以确保D R M 移至正确的梯度。
对于贴壁细胞，细胞间需进行比较的细胞系 lb. 如需比较两个不同的细胞类型间D R M 的丰度和得率，按照步骤Ia所示用培养皿培养不同细胞类型的细胞，对每种细胞另接种一个培养皿（以测定培养物的蛋白质含量），确保每个培养皿的细胞数相同。 2b. 用 5 ml T N E 缓冲液漂洗每种类型细胞的一个培养皿2 次 ，用 I m l 含 有 1 % TritonX -100或 者 0. lmol/L 碳酸钠的 T N E /P 缓冲液裂解细胞。将黏稠的细胞裂解物立即转 移 至 1.5m l 微量离心管内，并 通 过 22 G 针头连接的 I m i 注 射 器 1 0 次（或直到黏滞性消失）以剪切D N A 。然后以最大速度离心。 3b. 用去污剂相容的蛋白质检测试剂盒测定5〜IOul等份裂解物的蛋白质含量。将 T N E缓冲液与含有2 % 或 5 % Trit〇n X -100的 T N E 缓冲液混合，来制备含有足量TritonX -100的 T N E /P 缓冲液，使 用 去 污 剂 ：蛋 白 质 为 10 : I (m /m ) 混 合 。为增加与脂筏结合较弱蛋白质的得率，使用去污剂：蛋白质为2 : 5 (m /m ) 混合。 4b. 加 入 I m l 含 有 1 % Triton X -IOO 的冰冷T N E /P 缓冲液至剩余的培养皿中，在冰上裂解细胞20 min，在裂解缓冲液中加入0.lmol/L 碳酸钠， p H l l ，以便更好地定量D R M 脂类得率，提 高 D R M 脂质得率，或减少外周或细胞骨架蛋白与D R M 的结合 。在分析 D R M 中的酶活性时，不能使用碳酸盐。按照步骤3a 所示操作；如果有必要，按照步骤4a 所示操作。 对于非贴壁细胞 Ic. 培养约5X 107个细胞，并 4°C ， 200g离 心 5 min。如需进行细胞间的比较时，应使细胞(来源相同）数量相同。对于脂类分析（见辅助方案3)，使 用 2X 108的非贴壁细胞。 2c. 用 5m l 冰 浴 的 T N E 缓冲液重悬细胞，重 复 洗 2 次 。 3c. 用 2m l 含 有 1 % 的 Triton X -100的 T N E /P 缓冲液在冰上裂解细胞20 min。在裂解缓 冲 液中加入〇.lmol/L 碳 酸 钠 ， p H l l ，以 便 更 好 地 定 量 D R M 脂 类 得 率 ，提髙D R M 脂质得率，或减少外周或细胞骨架蛋白与D R M 的结合。在 分 析 D R M 中的酶
活性时，不能使用碳酸盐。 4c. 如果有必要，按照步骤4a 进行操作。 5 . 将裂解产物与含有8 0 % 蔗 糖的冰冷T N E /P 缓冲液混合。对于来自贴壁细胞的裂解物 ，需要上述加至培养皿中的裂解缓冲液总体积为1.25倍 体 积（即对于 步 骤 3a 或4b 收集的裂解物，加 1.25 ml)。对于非贴壁细胞的裂解物，加 2. 5m l 。完全混合并静置几分钟以便减少泡沫。 6 . 转移至一个或多个S W 4 1 超速离心管内，移去可能存在的泡沫。每管不超过5 ml。用冰冷的含有3 5 % 蔗 糖 的 T N E /P 缓 冲 液 6〜7m l 小心地覆盖到裂解物/蔗糖复合物上(分层应尽可能的宽），开始倒入液体时应注意观察以确保其可以浮在上层。如果没有浮起，则从微量离心管中移去混合物，并彻底混合。如果必要的话，加入少量的8 0 % 蔗糖。 7 . 用 含 5 % 蔗 糖 的 冰 冷 T N E /P 缓 冲 液 填 充 离 心 管 至 距 离 顶 端 约 3m m 。配 平 ， 4°C ，l 〇0 00Qg 离心> 3 h (至 24 h)。 蛋白质梯度分布的检测 8a. 从底端分段收集梯度上的成分，每 份 收 集 lml。加 2 X 或 6 X S D S /样品缓冲液，通过 SDS-P A G E (单 元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹 法（单 元 12. 5 ) 分析其中 50〜100ul 组分。 对于无需免疫沉淀的免疫印迹 8b. 用 5m l 注 射 器 22 G 针头从离心管的顶端在 5%/35% 蔗糖交界处收集可见的条带置于 1 个 S W 4 1 超速离心管中。用 冰 冷 的 T N E /P 缓冲液稀释该膜成分，直到注满离心管。 4°(：， 100 00(^离心 111。 9b. 移弃上清液。用 100〜2 0 0 4 T N E /P 缓冲液移出沉淀物并移至一微量离心管内。用200ul T N E /P 缓冲液清洗超离心管 3 次 ，刮擦管底部以收集沉淀物碎片。将这些清洗液与沉淀物合并。 10b. 4°C ，最高转速离心 IOmin 以沉淀 D R M 。弃上清液。直接用 2X 或 6X S D S /样品缓冲液溶解 D R M ，通 过 SDS-PAGE (单元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹（单 元 12. 5 ) 进行分析。 对于低分子质量蛋白质 8c. 依步骤 8b〜IOb 制 备 D R M 沉淀物，不 用 S D S /样品缓冲液来溶解。加 I m l 冰冷的丙酮 至 D R M 沉淀物里，涡旋混勻，置 冰 上 孵 育 lOmin。 4°C ，最 高 转 速 离 心 lOmin，移弃丙酮。 9c. 在室温下加 I m l 二乙基醚至管内，涡旋混勻，如上述操作进行沉淀。移去醚并风干。用 2 X 或 6X S D S /样品缓冲液溶解 D R M 蛋白，以 S D S - P A G E (单 元 12. 3 ) 和免 疫 印 迹 法（单 元 12. 5 ) 进行分析。 免疫沉淀后的免疫印迹 8d. 依照步骤 8b〜IOb 制 备 D R M 沉淀物，不 用 S D S /样品缓冲液来溶解。用 I m l 含有1 % Triton X -IOO 的 T N E /P 缓 冲 液 溶 解 D R M ，置 37°C 孵 育 5 min，或 者 加 入 Iml含 有 60m m o l /L 辛（烷）基葡糖苷的 T N E /P 缓冲液，置冰上孵育 20 min。 9d. 4°C ，最高转速离心 5 min，以沉淀任何残存的不溶性物质。将澄清的可溶性 D R M移至新管，通 过 免 疫 共 沉 淀 试 验（单 元 12. 2 ) 回收目的蛋白，以 S D S - P A G E (单元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹 法（单 元 12. 5 ) 进行分析。 备 选 方 案 用 离 心 法 制 备 去 污 剂 抗 性 的 膜附 加 材 料
在 S D S 中的溶解
3a 用 100ul 沉淀物裂解液重悬 Triton X -IOO的裂解沉淀。使混合物通过带22 G 针头的I m l 注 射 器（以剪切D N A ) 至均一。用 I m l 包 含 1 % Triton X -100的 冰 冷 T N E / P缓冲液进行稀释， 4°C ，最大速度离心 2 min，保留上清，弃去剩余的不溶性物质。 4a. 为 了 进 行 2 个组分的比较，用 2 0 % 的 S D S 储 存 液 将 初 始 的 Triton X -100 上清液(步骤 2 ) 调整至终浓度 0.1% S D S 。用 免 疫 共 沉 淀（单 元 12. 2)、 S D S - P A G E (单
元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹（单 元 12. 5 ) 对等量的 2 个组分进行分析。 在 辛 基 葡 糖 苷 中 的 溶 解 3b. 用 I m l 含 有 60 mmo l /L 辛 基 葡 糖苷的冰冷的 T N E /P 缓 冲 液 于 冰 上 重 悬 Triton X -100 裂解沉淀 20 min，以便溶解 D R M 蛋白。涡旋混勻， 4°C ，最高速 度 离 心 2 min，保留上清液并弃去沉淀。 4b 通过免疫沉淀（单 元 12. 2)、 S D S - P A G E (单元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹（单 元 12. 5 ) 等方法，对等量的该组分及原始的 Triton X -100 裂 解 上 清（步 骤 2 ) 进行分析。 辅 助 方 案 1 脉冲追踪方法分析去污剂抗性的膜蛋白附 加 材 料
辅 助 方 案 2 通过放射性标记检测去污剂抗性的膜蛋白的全部组分附 加 材 料P B S ，无菌 无甲硫氨酸、包含透析血清的培养基（透析血清方法见附录 1 ; 用量取决于细胞类型） [35S] 甲硫氨酸 1 . 在 I O c m 组织培养皿里接种贴壁细胞。如果有必要，将待测细胞接种于两个培养皿里 ，但是只对其中一个培养皿进行标记（对于非贴壁细胞，接 种 5 X 1 0 6 个细胞，离
 辅 助 方 案 3 定 量 高 效 薄 层 色 谱 法（HP-TLC) 进 行 DRM 脂质分析材 料甲醇 氯仿 I : 1 和 2 : I (V /V ) 氯仿/ 甲醇 溶 剂 A : 30 : 60 : 8 (V /V A O 氯仿/甲醇/水 硅 焼 化 试 剂（Sigmacote， Sigma) D E A E 葡 聚 糖 凝 胶（Sephadex) 混 悬 物（见辅助方案 4) 溶 剂 B : 30 : 60 : 8 (V 7V7 V ) 氯仿/甲醇/0• 8mol/L 乙酸钠 8 : 4 : 3 氯仿/甲醇/0. lmol/L 氯化钠 0.lmol/L 氯化钠 溶 剂 C : 3 : 48 : 47 (W V /V ) 氯仿/ 甲醇/0.lmol/L 氯化钠 溶 剂 D : 3 : 48 : 47 (V /V /V ) 氯仿/ 甲醇/水 氮气 反 相 C 1 8 柱（见辅助方案 5) 中性脂质标准品 酸性脂质标准品 乙酸 甲酸 己烷 异丙醚 脂类显影试剂 S W 2 8 转 子 和 超 速 离 心 管（Beckman) 带 Teflon 内衬盖子的 15m l 玻璃管 大 功 率（Laboratory Supplies，型 号 G S P 1T ) 或标准浴槽超声破碎仪 24m m Whatman G F /C 玻璃纤维滤器 过滤设备：玻璃微量分析过滤装置（Fisher) ，或以 橡 胶 垫 圈 插 入 125m l 侧臂烧瓶的 24m m Buchner 漏斗 带磨口玻璃瓶颈的 125m l 平底烧瓶和管子 旋转蒸发器 玻璃棉 一 次 性 IO m l 宽口玻璃移液管 玻璃棒 IO m l 硅烷化移液管 5m l 带 T e f lo n 内衬盖子的锥形玻璃管 带单孔瓶塞的 125m l 侧臂烧瓶 无荧光指示剂的 1 0 c m X 2 0 c m 髙 效 薄 层 色 谱（H P -T L C ) 板（Merck) 带玻璃盖的薄层色谱缸 预 热 至 l〇〇°C 、 110°C 、 180°C 的烤箱 改 良 的 IOjL d H a m ilton 注射器：带有斜切边缘的注射器，可将上样角度减少一半，有利于少量滴剂的上样 带磨口玻璃塞的 IOOm l 刻度量筒 剪成色谱缸大小的吸水纸 有冷却装置的吹风机 0.5 〜I c m 厚错块 光密度计 注 ：所有接触 D E A E 葡聚糖凝胶的玻璃制品使用前均要硅烷化处理。玻璃棉装好后 ，把玻璃棉和柱子一同进行硅烷化处理。 1 . 准 备 1 0 瓶 I O c m 培养皿贴壁细胞的裂解产物（见基本方案，步 骤 Ia〜4a) 或 者 2 XIO8 个的非贴壁细胞的裂解产物（见基本方案，步 骤 Ic〜4c)。 2 . 利用蔗糖梯度浮选法制备 D R M (见基本方案，步 骤 5〜7)。从交界面处获取并离心收 集 D R M (见基本方案，步 骤 8b〜IOb) ，使 用 S W 2 8 而不用 S W 4 1 转子并且按比例增加体积。 3.D R M 沉 淀 中 加 入 I m l 甲醇，剧 烈 振 荡 至 沉 淀 悬 起 ，移 入 带 有 T e f l o n 内衬盖子的1 5 m l 玻璃管中。用 I m l 甲 醇 洗 2 次 ，将每一次的洗液合并入原管。再 加 入 3m l 氯
仿 ，随后加入 6 ml 1 : 1 (W V ) 甲醇和氯仿混合物。 4 . 应用高强度浴槽型超声破碎仪（推荐使用）或者标准超声破碎仪处理几秒。室温振荡孵育过夜。在真空中用 24m m Whatman G F /C 玻璃纤维滤器过滤到 125m l 侧臂烧瓶中。 5 . 用 IOml I : I (V7 V ) 甲醇和氯仿溶液冲洗过滤器。将溶液倒入一个适用于旋转蒸发器的带磨口玻璃瓶颈的 125m l 平底烧瓶中，用旋转蒸发器干燥。置 5m l 溶剂 A 中溶解脂质。 6 . 用玻璃棒将一小卷玻璃棉塞到一个 IO m l 宽口玻璃移液管的尖端。把柱子装在环状支架连接或者用夹子夹住。将 2 m l 硅烷化试剂注入移液管和玻璃棉。 5m l 甲醇冲洗并且确保玻璃棉没有沾在移液管内侧壁上。 7 . 用一只 IOm l 硅烷化移液管，向柱内加入足够量的 D E A E 葡聚糖凝胶以形成一个 2m l 柱床。用 10 倍柱体积的溶剂 A 填塞柱子。用巴氏移液管将溶解的脂质上柱。用 10 倍柱体
 16.用 I : I (V /V ) 氯仿/甲醇溶解脂质。调整每个样品的浓度，预计上样量为 5〜20ul(每种脂质含量在 1〜7/xg) 。 试验几种浓度以确保有一种浓度在标准曲线范围内。 17.用改良的 10M1 Hamilton 注射器上第一个样品，在起始线的两个点之间点入一系列扩 散 至 5m m 宽的极小液滴。使溶剂短暂干燥后接着在前一样品上点入更小的液滴，持续点样直至所需的上样量。 1 8 . 将剩余样品上样，并选取合适的中性或酸性脂类对照，上 样 5 ul (含 1 〜 7ug脂质），将平板室温干燥 5m in 。 临用前在带磨口玻璃塞的 IOOm l 量 筒 中 配 制 70. 8m l 溶 剂 I :4 2 m l 氯仿、 1 8m l 甲醇、 7 . 2 m l 乙酸、 2 . 4 m l 甲酸和 1 . 2m l 蒸镏水。 19.在 T L C 缸中加入溶剂和吸水纸，使吸水纸饱和，立 即 以 玻 片 盖 住 并 以 重 物（如两个装满液体的 4L 水罐）压住防止挥发。将 点 有 样 品 的 T L C 平 板 放 于 T L C 缸 中 ，使起始位置处在缸底部，立即盖上并压上重物。 20.溶剂前沿泳动至距离平板底部 6 cm (到达事先用铅笔标记的位置）时 ，从缸中取出平板，风 干 15〜30 min。如果有必要也可用电吹风的冷风吹干。溶剂挥发期间可同时在带磨口玻璃塞的IOOml 量筒中配制 102m l 的溶剂体系 II: 65m l 己烧、 35m l 异丙 醚 和 2m l 乙酸。 21.在另一个 T L C 缸中加入溶剂和吸水纸，使吸水纸饱和，立即盖住防止挥发。当第一溶剂挥发后，将点有样品的T L C 平板放于 T L C 缸中。泳动至溶剂前沿到达平板顶 部（10c m )。从缸中取出平板，风 干 15〜30 min。将用过的溶剂丢弃，吸水纸彻底风干留作再次使用（可重复使用若干次）。 22.将平板浸于脂类显影试剂中，或者在通风橱中将该液体喷于板上，使其湿透。将其竖起流干液体至板的光泽淡去。 23.将平板置于预热 100°C 的烤箱中烘干 1 〜2m in ， 待其颜色改变之前取出，然后放置于另一 1 8 0 °C 烘箱中的 0. 5〜I . O cm 厚铝块上干燥 5〜lO m in ， 至颜色充分显现但尚未出现背景颜色时取出，冷却待用，如 需 要 保 存（可 达 24 h) ，则 应 以 旧 的 T L C 平
板（其上硅胶均已去除）覆盖，用塑料膜包裹住，保存于一 20°C 。 2 4 . 在 24 h 内以密度仪扫描色带，利用中性或酸性脂质标准品绘制标准曲线，将样品与适当的标准曲线进行比对测定。 展开 | 