(1) 选择经 24h~48 h 培养的 4X106/ ml 鸡胚成纤维细胞若干瓶。
(2) 将细胞瓶按病毒稀释度分组标记,每个稀释度为 2 瓶,对照 2 瓶。
(3) 配制含 2%~5%小牛血清的 0. 5% 水解乳蛋白的 Hanks 稀释液 100ml:0. 2%或 0. 5%Hanks 液 97 ml(也可用 Eagle MEM 或 RPMI 1640 培基),灭活小牛血 2 ml,双抗(10 000U/ml )1ml, 调 pH 至 7. 4~7. 6 。
(4) 在冰浴盘内用稀释液将病毒作一系列 10倍递增稀释。
(5) 用 Hanks 液 (pH 约 7.8) 洗涤细胞层约 1~2 次(轻洗勿使细胞脱落)。
(6) 将每个病毒稀释液接种 2瓶细胞,每瓶(小方瓶)接种 0. 5 ml 病毒(大方瓶接种 1 ml入轻轻摇匀。
(7) 置 37℃ 5%CO2 培养箱中吸附 1 h, 中间摇动一次,切勿倒置。
(8) 加含培养基的融化琼脂,每大瓶加 10 ml 每小瓶加 5 ml, 控制温度在 45℃~50℃左右加入,以防凝固。培养基琼脂配制法: 6 ml 灭活小牛血清, 1 ml 双抗 (20 000U/ml), 1 ml 卡那 (20 000U/ml), 90 ml 0. 5% Hanks 液,2~3 ml 7. 5% NaHCO3, 加入等量 56℃ 融化的 3% Hanks 琼脂液并摇匀。
(9) 冷凝后翻转细胞培养瓶,置 37℃5%C02 培养箱中培养 24 h 。
(10) 每瓶中加入 0.2% 中性红,小瓶 0. 25 ml( 大方瓶加 0. 5ml) 摇匀, 37℃ 5% CO2 培养箱中培养 4 h 后,翻转培养瓶继续培养。(注:若需保存空斑时,可在每瓶中加人 3%氯化采 0. 5 ml, 并摄影记录)。
(11)A 组虫媒病毒培养 24 h,B 组虫媒病毒培养 72 h 观察结果。
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