一、材料准备 1. 小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备
(1)将BALB/c小鼠眼球放血处死,用750 mL/L 乙醇消毒小鼠皮肤后。
(2)腹腔注射5 mL RPMI1640基础培养基。
(3)轻揉小鼠腹部5 min,从侧腹壁小心抽吸出液体,收集细胞到15 mL 的离心管中,于4℃以1500 r/min,离心5 min,弃上清,用RPMI1640基础培养基重悬,并将细胞密度调整为2×109个细胞/L,接种到96/24孔细胞培养板中,于37℃、50 mL/L CO2培养箱培养。
(4)3 h 后弃上层培养液,用冷的RPMI1640基础培养基轻轻洗涤2次,去除未贴壁细胞即得已贴壁的巨噬细胞。 二、实验步骤
1. 对照实验
(1)实验设置空白对照组(加DMEM完全培养液)、对照组(加巨噬细胞悬液)、Sal80 μmol/L 组、Sal160 μmol/L 组和Sal320 μmol/L 组,每组设3个复孔。
(2)将取密度为2×109个细胞/L的腹腔巨噬细胞接种于96孔板中,每孔添加190 μL的RPMI1640基础培养基,并加入10 μL的Sal工作液,使其终浓度分别为80 μmol/L、160 μmol/L 及320 μmol/L,于37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养48 h。
(3)每孔加入20 μL (质量浓度为5mg/L)MTT,避光孵育4 h 后,离心(1500 r/min,5 min)弃上清,每孔加100 μL 二甲基亚砜(DMSO),于振荡器上避光振荡10 min 以溶解孔底紫色结晶,在酶标仪于490 nm 波长检测各孔吸光度值,并计算细胞的相对存活率。
(4)细胞相对存活率=[(不同浓度的Sal组的A值-空白对照组的A值)/(对照组的A值-空白对照组的A值)]×100%。
2. 采用MTT比色法检测
(1)实验设对照组、LPS+IFN-γ组和Sal+LPS+IFN-γ组,每组设3个复孔。
(2)将密度为2×109个细胞/L的腹腔巨噬细胞接种到96孔板中,每孔添加190 μL的RPMI1640基础培养基,并加入10 μL不同浓度的Sal(终浓度为80、160、320 μmol/L)培养4 h。
(3)加入LPS9(终浓度为10 mg/L)和IFN-γ(终浓度为80 μg/L),于37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养48 h。
(4)每孔加入20 μL的MTT(终浓度为5mg/L),继续培养4 h后离心(1500 r/min,5 min)。
(5)弃上清,每孔加入100 μL DMSO,震荡10 min,酶标仪于波长490 nm检测A值,并计算Sal对巨噬细胞的增殖促进率。
(6)促进率=[(Sal+LPS+IFN-γ组的A值—LPS+IFN-γ组的A值)/LPS+IFN-γ组的A值]×100%。
3. 采用SytoxGreen染色法检测
(1)实验设对照组、CHX和Sal+CHX组,每组设3个复孔。
(2)将密度为2×109个细胞/L的腹腔巨噬细胞接种到96孔板中,添加190 μL RPMI1640基础培养基,将10 μL终浓度为160 μmol/L的Sal工作液加入到贴壁的巨噬细胞中。
(3)培养4 h 后,在CHX组加入终浓度为0.5 μmol/L 的CHX,继续于37℃、50 mL/L CO2孵箱中培养48 h。
(4)加入终浓度为0.5 μmol/L的Sytox??Green对96孔板中的巨噬细胞室温下染色15 min,用荧光酶标仪检测巨噬细胞Sytox Green染色的荧光强度。
4. 采用免疫荧光微球法检测
(1)实验设对照组、LPS+IFN-γ组、不同浓度的Sal组和Sal+LPS+IFN-γ组,每组设3个复孔。
(2)将密度为2×109个细胞/L的腹腔巨噬细胞接种到24孔培养板中,每孔加500 μL RPMI1640基础培养基,并加入10 μL 不同浓度的Sal(终浓度为80、160、320 μmol/L)。
(3)37℃、50 mL/L CO2培养箱4 h。
(4)加入终浓度为10 mg/L的LPS和终浓度为80 μg/L的IFN-γ,于37℃、50 mL/L CO2培养箱中孵育24 h,最后加入直径为1 μm 的荧光微球(终浓度为1×1010/L),继续培养2 h。
(5)轻轻吸掉上清,用PBS轻轻洗涤清除未吞噬的微球,然后用胰酶将贴壁的腹腔巨噬细胞消下来。
(6)收集细胞,离心(1500 r/min,5 min),用200 μL PBS重悬后立即用FCM进行检测。
5. 采用H2DCFDA染色法检测
(1)实验设对照组、LPS+IFN-γ组和Sal+LPS+IFN-γ组,每组设3个复孔。
(2)按照密度为2×109个细胞/L的腹腔巨噬细胞接种到96孔培养板中,每孔加入190 μL 的RPMI1640基础培养基,并加入10 μL 不同浓度的Sal(终浓度为80、160、320 μmol/L)。
(3)37℃、50 mL/L CO2培养箱4 h。
(4)加入终浓度为10 mg/L 的LPS和终浓度为80 μg/L的IFN-γ,于37℃、50 mL/L CO2培养箱中孵育24h。
(5)弃上清,用终浓度为5 μmol/L 的H2DCFDA染液,每孔加100 μL 染液避光室温染色30 min。
(6)用荧光酶标仪进行检测,其发射光波长为485 nm,检测光波长为520 nm。
6. 采用Griess试剂盒法检测
(1)实验设对照组、LPS+IFN-γ组和Sal+LPS+IFN-γ组,将密度为2×109个细胞/L的腹腔巨噬细胞接种到24孔培养板中。
(2)每孔加500 μL RPMI1640基础培养基,并加入10 μL不同浓度的Sal(终浓度为80、160、320 μmol/L)。
(3)37℃、50 mL/L CO2培养箱培养4 h。
(4)加入终浓度为10 mg/L 的LPS和终浓度为80 g/L 的IFN-γ。
(5)37℃、50 mL/L CO2培养箱中孵育24 h,吸取50 μL 上清于96细胞培养板中,按Griess试剂盒说明书进行检测,用酶标仪于波长540 nm 检测A值。
(6)同时按Griess试剂盒说明书绘制标准曲线并计算得出各组产生的NO量。
7. 统计学分析:结果用x±s表示,n为样本量。统计作图软件用MicrosoftExcel。组向比较采用One-wayt检验,P<0.05为具有统计学意义。 展开 |