1. 动物分组及用药
(1)将40只小鼠随机分为正常对照组10只和荷瘤组30只。
(2)正常组于右腋下皮下注射生理盐水0.2 ml/只,荷瘤组右腋下皮下注射瘤细胞悬液0.2 ml/只。
(3)荷瘤组随机分为3组,并于肺俞及接种局部脱毛(腧穴定位参考林文编5实验针灸学6),于次日开始治疗。
(4)模型对照组贴敷无药硬膏。
(5)局部贴敷组用抗癌膏贴敷接种局部。
(6)穴位贴敷组用抗癌膏贴敷肺俞穴及接种局部,各组均隔日更换膏药,共治疗14天。
(7)正常对照组不做药物处理。于第15日处死小鼠,摘眼球取血,取脾脏。 2. 检测方法:脾NK细胞活性检测。
(1)脾NK细胞的制备
①无菌取小鼠脾脏,制成脾细胞悬液,离心后取沉底脾淋巴细胞
②用含10%FCS的1640完全培养液移入100 ml 细胞培养瓶中
③37℃、5%CO2下培养4 h,调整细胞浓度为6×106/ml,备用。
(2)靶细胞:传代培养的YAC-1细胞在实验前一天换液,调整浓度为3×105/ml。
(3)NK细胞杀伤活性的测定
①用96孔细胞培养板。
②每份样品设
a:效应细胞自发释放孔(效应脾细胞0.1 ml,完全培养液0.1 ml)
b:靶细胞自发释放孔(靶细胞0.1 ml,培养液0.1 ml)
c:杀伤实验孔(靶细胞0.1 ml,效应脾细胞0.1 ml)
d:最大杀伤实验孔同c,每孔设3个重复孔,离心,弃上清液0.1 ml,加入0.1 ml 2%X-100。
③于37℃、5%CO2下培养24 h,离心(1000 rpm,5 min)。
④弃上清液,每孔加NAG酶反应物液100 ul,置湿盒37℃温育40 min。
⑤每孔加中止液100ul,在酶联检测仪410 nm处测A值,分别以a、b、c、d表示。
⑥按下公式计算NK细胞杀伤活性:细胞毒指数(CI)=(a+b)-c(a+b)-d×100%。
3. IL-活性测定:
(1)脾细胞制备同上。
(2)IL-2的诱生
①将6×106/ml脾细胞悬液加入24孔培养板中,调整细胞浓度为10 ug/ml。
②37℃、5%CO2下培养48 h(1000 rpm,10 min)收集上清液。
③无菌塑尖管为待测样品,-20℃保存检测活性。
(3)活性测定
①以IL-2依赖细胞株CTLL-2为靶细胞,用20%FCS的1640培养液调整浓度为2.5×105/ml,加入96孔培养板,每孔100 ul。
②再加入100 ul待测样品,每份样品设三个重复孔,并设阴性对照孔。
③培养48 h后离心(2000 rpm,10 min),弃上清液。
④加NAG酶反应底物100 ul,置湿盒37℃温育40 min后,每孔加中止液100 ul,在酶联检测仪410 nm处测A值。
⑤按下列公式计算CTLL-2增殖率,表示IL-2活性。增殖率(%)=样品A值-阴性对照孔A值阴性对照孔A值×100%。
4. 统计方法采用 t 检验。 展开 |