| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 糖原EDTA缓冲液SDSBSATween 20连接子T4 DNA 连接酶BsmFIPC8SeeDNA乙酸钠乙醇DMSOPCR引物乙酸铵DNA ladder聚丙烯酰胺 TBE凝胶DNA参照pZErO-1 质粒TE缓冲SOC培养液Tris · Cl |
| 仪器、耗材 | 微量离心管水浴锅带冷冻的热控制 循环仪96 孔 PCR 板干冰 甲醇浴台式离心机平台型摇床UV 盒滤镜Spin-X 离心过滤管微电击杯Bio-Rad 基因脉冲电转装置培养管 |
| 实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1. 刮取细胞时准备 Dynabeads ，洗涤缓冲液和 5×第一链缓冲液混合液（置于冰上）。 2. 充分悬起 Dynabeads oligo （dT）25，转移 100 ul 到一个无 RNase 的硅烷化微量离心管里，置于磁座上。30 s 后去除上清，不要扰动磁珠。 3. 轻弹或轻轻涡旋把磁珠重悬于 500 ul 裂解/结合缓冲液中。把磁珠留在缓冲液里直到准备把它加到细胞裂解液里。加到细胞裂解液里前移出磁珠。 4. 在一个 2 ml 的微量离心管里用 1ml 的裂解/结合缓冲液裂解 100 000 ～ 1000 000 个细胞（或 2～10 mg的组织），用组织匀浆器匀浆 1 min。如果有必要的话，最高速离心 1 min 去除细胞残渣。使用匀浆器前，彻底清洗，再用 100％ 的乙醇淋洗，用 1L 的 DEPC 处理的双蒸水洗涤。 5. 立刻用一个 1 ml 的注射器使裂解液通过一个 23-G 的针头撕裂基因组 DNA 。把洗过的磁珠和裂解液混合，室温用手连续晃动温育 3～5 min。 6. 把管子放到磁座上 2 min，弃掉上清（上清可以保存用作 DNA 的实验）。 7. 用一个 P200 带滤芯的吸头上下吹吸洗涤磁珠。按下面的顺序洗涤： 7.1 1 ml 含20 ug/ml 糖原的洗涤缓冲液 A（1 ml 洗涤缓冲液中加入 1 ug 20 mg/ml 的糖原），两次。 7.2 1 ml 含20 ug/ml 的糖原的洗涤缓冲液 B， —次。 7.3 200 ul 1× 第一链缓冲液混合液（用 DEPC 水从试剂盒中的 5× 第一链缓冲液混合液稀释），4次。 8. 把磁珠重悬于下面的第一链合成混合液里： 54 ul DEPC ddH2O 18 ul 5× 第一链缓冲液 9 ul 0.1 mol/L DTT 4.5 ul 10 mmol/L dNTP 把管子置于 37°C 2 min， 然后加入 3 ul 200 U/ul SuperScript II 逆转录酶。37°C 温育 1 h， 每 10 min 用手混匀磁珠。把管子置于冰上中止反应。 9. 在冰上往第一链的反应里加入如下第二链合成的成分，次序如下： 227 ul ddH2O， 预冷 150 ul 5× 第二链缓冲液 15 ul 10 mmol/L dNTP 3 ul 10 U/ul E.coli DNA 连接酶 12 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶 I 3 ul2 U/ul E.coli RNase H 16°C 温育 2 h， 每 10 min 用手混匀磁珠。 10. 温育后，把管子置于冰上加入 100 ml 0.2 mol/L EDTA 中止反应。 11. 用含 0.1％ SDS 和 2× 乙酰化 的 BSA 的 1×BW 缓冲液洗一次（ 如果不加 BSA ，珠子会变得很黏）。 12. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1XBW 缓冲液洗 3 次。重悬在 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液中，70°C 加热 20 min 失活 Poll 的核酸酶活力。 13. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液洗 3 次。然后用 200 含 2×BSA 的 1×NEB 缓冲液4 （随 NlaⅢ 提供）洗 2 次（第一次用 NEB 缓冲液/ BSA 洗完后转移到一个新管里）。取 5 ul 最后的磁珠悬液，用已知存在于所要建库 cDNA 中的基因引物，PCR 检查 cDNA 的完整性 14. 把磁珠重悬于下面的混合液中： 171 ul LoTE 缓冲液 4 ul 100×BSA 420 ul 10×NEB 缓冲液 4 5 ul NlaⅢ 37°C 温育 1 h。 15. 温育后，把管子置于磁座上约 30 S，然后用下面的溶液和 P200 带滤芯的吸头上下吹吸几次洗涤： 500 ul 含 1％ Tween 20 和 2×BSA 的 1×BW 缓冲液，2 次 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液，4 次 200 ul 1×T4 DNA 连接酶缓冲液，2 次 最后重悬于连接酶缓冲液后，每个样品转移 100 ul 到 2 个新的硅烷化的微量离心管里。 16. 移弃最后的洗涤液，珠子重悬在下面的溶液里： 5 ul LoTE 缓冲液（两管） 2 ul 5×T4 DNA 连接酶缓冲液（两管） 3 ul 2 ng/ul 连接子 1A，B （已复性的；管 1） 3 ul 2 ng/ul 连接子 2A，B （已复性的；管 2） 17. 50°C 加热管子 2 min 后置于室温 5～10 min。每管中加入 1 ul 5 U/ul 高浓度 T4 DNA 连接酶，16°C 温育 2 h。间歇混匀。 18. 连接后，置于磁座上约 30 s，然后每个样品用 500 ul 含 0.1 ％ SDS 和 2×乙酰化的 BSA 的 1×BW 缓冲液洗两次（第一次洗后合并管 1 和管 2，以减少后续步骤的损失）。 19. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液洗 4 次 ； 用 200 ul 含 2×BSA 的 1×NEB 缓冲液 4 洗两次（第一次用 NEB 缓冲液/BSA 洗后，转移到一个新的管里）。 20. 65°C 预热下面的混合液 2，重悬起磁珠： 170 ul LoTE 缓冲液 4 ul 100×BSA 20 ul 10×NEB 缓冲液 4 2 ul BsmIII 65℃ 温育 1 h，间歇混匀。 21. 温育后，最高速离心 2 min， 然后转移上清到一个新的 1.5 ml 的微量离心管。用 40 ul LoTE 缓冲液洗一次，最后终体积为 240 ml。 22. 用 240 ul PC8 抽提，用 4 ul SeeDNA 乙醇沉淀： 22.1 加入 4 ul SeeDNA ［或 4 ul 3：1 （V/V） 的糖原和 SeeDNA 混合物］ 22.2 加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠（24 ul）， 混匀 22.3 加入 2 倍体积的 100％ 乙醇（480 ul）， 混匀 22.4 室温温育 2 min 22.5 最高速离心 5 min 22.6 70％ 的乙醇洗两次，最后一次洗完后再离心一次，用吸头小心地移出并弃去残余液体，重悬于 10 ul LoTE 缓冲液。 23. 加入下面的混合液： 30. 5 ul ddH2O 5 ul 10×Klenow 缓冲液（或 Roche 缓冲液 H） 2.5 ul 10 mmol/L dNTP 1 ul 100×BSA 1 ul Klenow 37°C 温育 30 min 后，加入 190 ul LoTE 缓冲液（240 ul 终体积）。 24. 用等体积（240 ul） 的 PC8 抽提。转移 200 ul 到一个连接酶「＋」的管里，余下的 40 ul 到连接酶「-」的管里。 25. 用 2 ul SeeDNA、0.1 倍体积乙酸钠和 2 倍体积的 100％ 乙醇沉淀。70％ 乙醇洗两次，最后一次洗完后再离心一次，用吸头小心移去残余液体，晾干 5~10 min。重 悬于 2 ul LoTE 缓冲液。 26. 准备 2× 连接酶「＋」混合液： 2.5 ul 3 mmol/L Tris·Cl， pH 7.5 3.0 ul 5×T4 DNA 连接酶缓冲液 2.0 ul 5 U/ul 的高浓度 T4 DNA 连接酶 准备 2×连接酶「-」混合液：4.5 ul 3 mmol/L Tris ·Cl， pH 7.5 和 3.0 ul 5× T4 DNA 连接酶缓冲液。加入 2 ul 合适的混合液到＋/- 连接酶样品里，在热循环仪上 16°C 过夜（8～12 h）。 27. 连接后，加入 98 ul LoTE 缓冲液，优化 PCR 条件，然后进行大规模的 PCR 扩增。 28. 准备大规模 PCR 的反应混合液（2～3 个 96 孔板，每孔 50 ul 反应液），每个反应的成分如下： 5 ul 10×SAGE PCR 扩增缓冲液 3 ul DMSO 4.0～10 ul 10 mmol/L dNTP 1 ul 350 ng/ul PCR 引物 1 1 ul 350 ng/ul PCR 引物 2 用 ddH2O 调整体积到 49 ul 0.7 ul 5 U/ul Platinum Taq DNA 聚合酶 每孔分装入 49 ul 反应混合液，然后加入 1 ul 适当稀释的模板。 29. 热循环仪运行如下程序： 1 轮： 2 min 94°C 26～32 轮： 30 s 94°C（变性） 1 min 55°C（复性） 1 min 70°C（延伸） 1 轮： 5 min 70°C（终产物延伸） 连接酶「-」的样品应当扩增 35 轮。 不要对 Platinum Taq DNA 聚合酶使用传统的热启动 PCR。 30. 把 PCR 反应物混合到一个 50 ml 的锥形管里，用 LoTE 缓冲液扩大体积到 11.5 ml， 然后用等体积的 PC8 抽提。 31. 乙醇沉淀： 11.5 ml 样品 10 ul SeeDNA 100 ul 糖原 5.1 ml 7.5 mol/L 乙酸铵 38.3 ml 100％ 乙醇 干冰/甲醇浴 15 min。然后室温溶化 2 min。 32. 轻轻涡旋混匀，台式离心机的吊桶转子室温约 3000 g （4000 r/min） 离心 30 min。 33. 用 5 ml 70％ 的乙醇祸旋，洗漆，吊桶转子约 3000 g 室温离心 5 min。 34. 沉淀重悬于 216 ul LoTE 缓冲液。加入 54 ul 5× 上样缓冲液（终体积 270 ul）。 35. 3 个 20％ 聚丙烯酰胺/TBE 凝胶，每孔上样 10 ul。在 27 个泳道用加长的吸头上样，每个加 10 ul （不要过载）。每块凝胶加 10 ul 20 bp 序列阶梯作分子质量参照物。 36. 160 V 电泳 90 min 到距凝胶底约 1 cm，使 103 bp 的双标签片段和 80 bp 的连接子-连接子二者尽可能分开。 37. 在一个用锡箔包好的容器里染凝胶，50 ml TBE 缓冲液中加入 2～5 ul SYBR Green I。让凝胶在水平摇床上浸泡 15 min， 在用 SYBR Green I 或 UV 滤镜的 UV 盒上 观察。 38. 从凝胶上只割出扩增的带双标签的产物，把 3 个割出的凝胶放在硅烷化的 0.5 ml 离心管里（总共 9 个 0.5 ml 的管子），这些管子的底部都有一个直径约 0.5 mm 的 小孔（用 21-G 针头刺的）。 39. 把 0.5 ml 的离心管放在 2.0 ml 的硅烷化的离心管里，最高速离心 4 min （这样可以使聚丙烯酰胺凝胶打碎成小块，收集在 2.0 ml 的管底）。 40. 扔掉 0.5 ml 的离心管。每个 2.0 ml 离心管中加入 250 ul LoTE 缓冲液和 50 ul 7.5 mol/L 的乙酸铵。 41. 涡旋每个管子，然后置 65°C 15 min。在 18 个 Spin-X 离心管的滤膜上各加 5 ul LoTE 缓冲液。 42. 把每个管里的溶液转移到 2 个 Spin-X 的离心管滤膜上（即 9 管转移到 18 个 Spin-X 的离心管滤膜上）。最高速离心 5 min。合并两份洗脱液（总共 300 ul），转移到 1.5 ml 的微量离心管里。有时，纯化的 102 bp 的条带不能被 NlaIII 重新切开，这可能和纯化得不干净有关。如果出现这种问题，把 300 ul 洗脱液通过 Qiaquick 凝胶抽提方案抽提一次，终体积调回到 300 ul。 43. 洗脱液进行乙醇沉淀： 300 ul 样品 0.5 ul SeeDNA 1.5 ul 糖原 133 ul 7.5 mol/L 乙酸铵 1000 ul100％ 乙醇 涡旋，置于干冰/甲醇浴 15 min。室温 2 min 使融化，然后 4°C 离心 15 min。 44. 最高速离心 15 min。75％ 的乙醇洗两次。每管 DNA 重悬于 10 ul LoTE 缓冲液。 混合样品到一个管里（总量 90 ul）。 45. 用 NlaIII 消化 DNA： 90 ul LoTE 缓冲液中的 PCR 产物 226 ul LoTE 缓冲液 440 ul 10×NEB 缓冲液 4 4 ul 100×BSA 40 ul 10 U/ul NlaIII 37°C 温育 1 h。 46. 用等体积的 PC8 抽提。混合水相转移到 1.5 ml 微量离心管。在干冰上乙醇沉淀： 200 ul 样品 66 ul 7.5 mol/L 乙酸铵 3 ul SeeDNA 825 ul 100％ 乙醇 涡旋混匀，置于干冰/甲醇浴 15 min。 47. 室温 2 min 使融化，然后 4°C 离心 15 min。 48. 冷的 75％ 乙醇洗一次，用细头的吸头吸掉残余的乙醇。重悬沉淀于 40 ul LoTE 缓冲液。在冰上加入 5× 上样缓冲液（总共 50 ul）。 49. 把样品加到一个 20％ 聚丙烯酰胺凝胶的 4 个泳道中，隔开一个泳道加上 20 bp 序列阶梯作为分子质量参照物，160 V 电泳 2.5 h。用 1：10 000 的 SYBR Green I 染 15 min。 50. 在长波 UV 照射下切出 24～26 bp 的条带，每两个条带放到一个底部有约 0.5 mm 小洞的 0.5 ml 的微量离心管中（用 21-G 针头刺的）。 51. 把管子放在 2.0 ml 的硅烷化的离心管里，最高速离心 2 min。 52. 扔掉 0.5 ml 的离心管。每个 2.0 ml 离心管中加入 250 ul LoTE 缓冲液和 50 ul 7.5 mol/L 的乙酸铵。涡旋每个管子，然后置于 37°C15 min。不要在 65°C 温育。这会使得 26 bp 片段变性。可以温育更长一点的时间（甚至过夜），但看起来并不会显著提高产量。 53. 用 Spin-X 离心管滤膜按步骤 42 方法分离洗脱液。分在 3 个管里（每个 200 ul ） 进行乙醇沉淀： 200 ul 样品 66 ul 7.5 mol/L 乙酸钱 2 ul SeeDNA 3 ul 糖原 825 ul 100％ 乙醇 置于干冰/甲醇浴 10 min， 然后 4°C 离心 15 min。 54. 用冷的 75％ 乙醇洗两次。每个 DNA 样品重悬于 2.5 ul 冷的 LoTE 缓冲液（总共 7.5 ul）。在加入连接缓冲液前使纯化的双标签片段保持在冰上很重要。高 AT 含量的小片段即使在 LoTE 缓冲液中，室温下也会变性。 55. 混合下面的试剂： 7 ul 混合的双标签 DNA 2 ul 5×连接缓冲液 1ul 5 U/ul高浓度 T4 DNA 连接酶 16°C 温育 1～3 h。 不要连接过夜，因为这样会使得串联产物很长而难于克隆。 56. 连接完成后，加入 2.5 ul 5×上样缓冲液。65°C 加热样品 5 min，立刻置于冰上。 57. 在 10％～12％ 的聚丙烯酰胺/TBE 凝胶上分离串联体。在第一个泳道里加上 1 kb 的分子质量参照物，隔一个泳道把串联的样品全部加到第 3 个孔里。200 V 电泳 45 min。 58. 用 1：10 000 的 SYBR Green I 染 15 min。在 UV 盒上观察，分出感兴趣的区带。 59. 把每一块凝胶放入底部有约 0.5 mm 小洞的 0.5 ml 微量离心管中（用 21-G 针头刺的）。 60. 把 0.5 离心管连同凝胶块放入 2.0 ml 的硅烷化的离心管里，最高速离心 2 min， 把聚丙烯酰胺凝胶打碎成小块，收集在 2.0 ml 的管底。 61. 扔掉 0.5 ml 的离心管。2.0 ml 离心管中加入 300 ul LoTE 缓冲液。涡旋每个管子，然后置于 37°C 15 min。 62. 把每个管里的东西转移到 2 个 Spin-X 的离心管滤膜上（总共 4 个 Spin-X 管子）， 最高速离心 5 min。 63. 每两个 Spin-X 管子的洗脱液合并在一个 1.5 ml 离心管中，加入乙醇进行沉淀： 300 ul 洗脱液 2 ul SeeDNA 133 ul 7.5 mol/L 乙酸铵 1000 ul 100% 的乙醇 64. 最高速离心 15 min。70% 乙醇洗两次，晾干 5 min。纯化的串联 DNA 重悬于 6 ul LoTE 缓冲液。 65. 在10 ul 的体系里，用 SphI 消化 1 ug pZErO-1 质粒： 1 ul pZErO-1 质粒 7 ulddH2O 1 ul 10×NEB 缓冲液 2 1 ul SphI 37°C 温育 15～30 min, 然后 65°C 加热 10 min 灭活。不要消化超过 30 min。 66. 琼脂糖凝胶电泳检查消化是否完全。用 90 ul pH 8.0 的 TE 稀释切好的载体，然后用等体积 PC8 抽提。乙醇沉淀，75% 乙醇洗涤 2 次，重悬于 40 ul 水或 TE 缓冲液中（约 25 ng/ul 载体）。 67. 混合下面的连接反应液，同时配制一份不加串联体的对照反应： 6 ul 纯化的串联体（对照中不加） 1.5 ul dH2O （对照中 7.5 ul） 1 ul 25 ng/ul SphiI 切好的 pZErO 质粒 1 ul 10×T4 DNA 连接酶缓冲液 0.5 ul 4 U/V 的 T4 DNA 连接酶 16°C 温育 2 h。 pZErO质粒的厂商提醒如果温育时间长于 1 h 会使背景增高，原因可能是 ccdB 死亡基因上自然发生的突变。 68. 用 LoTE 缓冲液把样品调整到 200 ul 用等体积的 PC8 抽提，然后乙醇沉淀： 200 ul 样品 133 ul 7.5 mol/L 乙酸铵 2 ul SeeDNA 777 ul 100% 的乙醇 69. 70% 乙醇洗 4 次。最高速快速离心，弃去 70% 乙醇，晾干 5 min。重悬于 10 ul LoTE 缓冲液。
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