细胞碱性磷酸酶染色

实验概要

细胞碱性磷酸酶染色

实验原理

胚胎干细胞中碱性磷酸酶的活性比较高， 5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸盐（BCIP）能被碱性磷酸酶水解，形成一个中间体，这个中间体能与氯化硝基四氮唑蓝，也称氮蓝四唑（NBT）反应生成白色的中间二聚体和NBT-蓝紫色结晶物。通过染色结果可以相对得知碱性磷酸酶的活性，进而从侧面来证明实验细胞是否具有多能性，90%的克隆显色视为阳性。

主要试剂

DPBS、4% PFA、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）染色试剂盒

主要设备

倒置显微镜

实验步骤

（1）将贴壁培养的细胞用DPBS 洗3遍。
（2）加入4% PFA，固定细胞30 min。
！注意：多聚甲醛有毒，易挥发，对眼睛有刺激作用，在通风橱内操作，做好防护。
（3）吸弃4% PFA，然后用DPBS冲洗贴壁细胞3次。
（4）按照如下比例加入各溶液，混匀后配成BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品：

（5）37℃避光孵育5～30 min或更长时间（最长可达24 h），直至显色至预期深浅。
（6）DPBS洗3遍后，存放于DPBS溶液中保存，正置显微镜下拍照。