实验概要
本实验在构建了OsAGAP瞬时表达载体的基础上,采用基因枪轰击洋葱表皮观察了GFP的瞬时表达。
主要试剂
高渗培养液(MS无机盐、40g/L甘露醇),高渗固体培养基(MS无机盐、40g/L甘露醇、0.7% agar),无水乙醇,无菌去离子水,12.5 M CaCl2,0.1 M亚精胺,等渗培养基(MS培养基)
主要设备
高速离心机,1.5 ml Ep管,涡旋器,超净台,基因枪,气瓶,激光共聚焦显微镜
实验材料
洋葱内表皮
实验步骤
1. OsAGAP瞬时表达载体构建
以5'-CTTCTAGACCA GCC AGG AGA AAT CCA-3’为5’引物(下划线为引入的XbaI位点),5'-AAGGTACCAAA TTT CTG AAC GCA GC-3’作为3’引物(下划线为引入的KpnI位点)进行PCR扩增,将扩增到的片断克隆到pGFP221上,构成pGFP221-OsAGAP瞬时表达载体。
2. 基因枪轰击洋葱表皮观察GFP瞬时表达
1) 实验材料准备
撕取洋葱内表皮,置于高渗培养液(MS无机盐、40g/L甘露醇)中,室温100 rpm处理4 hours;然后转入高渗固体培养基(MS无机盐、40g/L甘露醇、0.7% agar)。
2) 金粉准备
a. 称取60 mg金粉放入1.5 ml Ep管(最好为烷硅化的进口管,减少金粉沾壁);
b. 加入1 ml的无水乙醇,涡旋振荡1-2 min;
c. 冰上静置5 min后,10,000 rpm离心1 min,去上清;
d. 重复a,b步骤重新清洗金粉三次;
e. 室温,10,000 rpm离心1 min,去上清;
f. 加入1 ml无菌去离子水,涡旋振荡1-2 min,冰上静置5 min;
g. 室温,10,000 rpm.离心1 min,去上清;
h. 重复g步聚两次;
i. 加入1 ml无菌去离子水,按50ul每份分装到己灭菌的1.5-ml Ep管中备用(分装时应在无菌条件下边涡旋振荡,以保证分装均匀)
(注:以10枪/3 mg计算,具体实验可按比例进行换算,无水乙醇清洗处理好的金粉可继续用无水乙醇中-20℃长时间保存,实验中金粉沾壁时,最好用超声波处理,不进行无菌培养的材料可以不需要严格的无菌操作)
3) DNA包裹金粉微粒(具体实验可按比例进行以下操作)
a. 取50ul金粉悬浮液(已分装好),在连续涡旋振荡下按顺序加入
5ul质粒DNA (1ug/ul)
50 X12.5 M CaCl2
20 ul0.1 M亚精胺
b. 涡旋振荡3 min;
c. 室温下离心10,000 rpm 10 sec,尽可能去净上清;
d. 加入250ul无水乙醇,涡旋振荡1-2 min;
e. 室温下离心10,000 rpm 10 sec,尽可能去净上清;
f. 加入60ul无水乙醇(可进行4-8次轰击)。
4) 基因枪轰击操作(无菌条件下进行)
a. 超净台紫外灯灭菌20min;
b. 载体膜、可裂膜、阻拦网等事先置于70%乙醇中1 min,灭菌滤纸上自然风干;将气瓶调节压力到1300psi;
c. 取8-9ul已用DNA包裹好的微粒悬浮液加到微粒载体膜中央,稍微晾干后马上进行轰击;
d. 将可裂膜、阻拦网、涂有微粒载体膜安装进固体装置中,射击参数为:轰击微粒运行距离为12cm,压力1110psi,真空度25mmHg;
e. 轰击结束后的材料,转移到等渗培养基(MS培养基)中培养一天一夜;
f. 使用激光共聚焦显微镜488nm波长激发下,观察GFP的表达。
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