实验概要
本实验介绍了Southern杂交的基本流程。
主要试剂
细菌基因组DNA抽提试剂盒，限制性内切酶，变性溶液，中和溶液，10 X SSC，杂交缓冲液(200mM磷酸钠缓冲液，PH7.2，1 mM EDTA，50%甲酞胺，1% BSA，7% SDS)，随机引物标记试剂盒，洗脱缓冲液(2 X SSC，0.5%SDS)
主要设备
电泳仪，电泳槽，振荡器，硝酸纤维素膜，Whatman滤纸，转移装置，紫外胶联仪，杂交瓶，Phosphorlmager
实验材料
假单胞杆菌
实验步骤
1. 用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取假单胞杆菌基因组DNA。
2. 取5ug基因组DNA经适当的限制性内切酶消化后，与上样缓冲液混匀，上样后120伏电压电泳约3小时。
3. 电泳结束后，用去离子水漂洗DNA胶，并照相。
4. 将DNA胶置于10倍体积变性溶液中室温下放置45分钟并轻轻振荡。
5. 用去离子水漂洗DNA胶，然后将胶转移至10倍体积中和溶液中室温下放置30分钟并轻轻振荡。
6. 将DNA胶转移至新的10倍体积中和溶液中室温下放置15分钟并轻轻振荡。
7. 搭建转移装置，并装入10 X SSC。
8. 切一张与DNA胶相同大小的硝酸纤维素膜和两张Whatman滤纸，并在膜左上角标记，先后用去离子水和10 X SSC漂洗。
9. 按顺序先后将DNA胶和硝酸纤维素膜铺在转移装置上，并用保鲜膜封边。再铺上两张Whatman滤纸，用500g重物压实，转移过夜。
l0. 去掉Whatman滤纸，在硝酸纤维素膜上标记加样孔的位置，用2 X SSC漂洗后晾干。
11. 用紫外胶联仪将DNA胶联到硝酸纤维素膜。
12. 配制杂交缓冲液。
13. 将膜放进杂交瓶，DNA而朝向空气。
14. 加入15mL杂交缓冲液，于42℃预杂交2-3小时。
15. 用随机引物标记试剂盒(Ambion)方法制备探针，变性后加入杂交瓶，杂交16-20小时。
16. 去掉杂交液，用预热至40-50℃的洗脱缓冲液，洗两次，每次5-10分钟。
17. 用预热至40-50℃的洗脱缓冲液(1X SSC, 0.5%SDS)洗两次，每次5-10分钟。
18. 用预热至40-50℃的洗脱缓冲液(0.5X SSC, 0.5%SDS)洗两次，每次5-10分钟。
19. 取出膜后晾干储存于Phosphorlmager。
20. 24小时后放射自显影。