钙钙调素对白杄花粉萌发和花粉管生长的调节

实验概要

本实验以白杄花粉为实验材料，用不同浓度钙调素拮抗剂TFP及外施钙调素处理培养的花粉，结合荧光标记和免疫抗体标记技术分析游离钙离子和钙调素在花粉管中的定位，探讨钙-钙调素信使系统在花粉萌发和花粉管生长过程中的生理作用。

主要试剂

1.      Ca₂(NO)₃和硼酸：以双蒸水溶解，配制成100×母液，4℃保存备用。

2.      TFP：购于Sigma，每次称取少量以双蒸水溶解，配成5 mg/mL的贮存液，4℃保存备用。

3.      Fluo-3AM：Molecular Probes产品，用无水DMSO溶解配成1mM的溶液，于-20℃下保存。

4.      钙调素：购自Sigma，溶解配成7.5×10^-2 mol/L的贮存液，-20℃保存备用。

5.      Monoclonal Anti-calmodulin和Anti-mouse IgG-FITC：购自Sigma，于-20℃分装保存。

6.      100 mM PBS缓冲液(pH 7.4)：分别称取NaCl 8.0 g， KCl 0.2 g， Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，KH₂PO₄ 0.2 g，依次溶解于800 ml双蒸水中，用1 N HCl调pH 7.4，定容至1000 mL。

7.      PME缓冲液：50 mM PIPES，0.5 mM MgCl₂，1 mM EGTA，pH 6.9：分别称取PIPES 1.512 g，EGTA 0.038 g，MgCl₂ 0.0102 g，用双蒸水溶解，调pH 6.9，加双蒸水定容至100 mL。

8.   3%多聚甲醛溶液：0.3 g多聚甲醛，加入8 mL PME缓冲液(pH 6.9)，50-60℃下加热 30 min，用少量1 N NaOH调pH 6.9，搅拌溶解。然后定容至10 mL。

主要设备

激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 510 META)

光学显微镜

摇床

实验材料

白杄花粉，5月上旬，采集白杄散粉之前的成熟小孢子叶球(雄球果)，置于室温下干燥48 h，待散粉后用无菌干燥小瓶收集成熟花粉，密封保存于-20℃备用。

实验步骤

1. 配制含不同浓度TFP的培养基

   1) 12%蔗糖 0.01%H₂BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ (CKM)

   2) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 1 µM TFP

   3) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 10 µM TFP

   4) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 100 µM TFP

   5) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 1 mM TFP

   6) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 10 µM TFP 0.1 µM CaM

称取花粉10 mg，室温下平衡30 min，悬浮于10 mL培养基中，25℃振荡(120 rpm)暗培养。

 2. 花粉萌发率和花粉管生长速度的测

    1) 花粉萌发率测定：花粉培养约12 h后开始萌发，每隔3 h取样统计花粉萌发率。当花粉管长度大于花粉粒直径时，认为花粉萌发。在光学显微镜下统计出萌发和未萌发的花粉粒数，根据公式：萌发率＝萌发的花粉数/总的花粉数×100%计算出萌发率。每个实验重复三次，每次所统计的花粉粒数目不少于300粒。

    2) 花粉管生长速率测定：体外培养12 h后，每隔6 h取少量样品，用含有与培养基等浓度的蔗糖的3%多聚甲醛溶液固定30 min。在光学显微镜下选取已萌发的花粉进行测量。每个实验至少测定200个花粉管，计算平均长度和标准差。

3. Fluo-3 AM低温装载

在不同处理的花粉悬浮液中加入1 mM Fluo-3 AM至终浓度为10 µM，混匀后放于4℃低温孵育2 h后取出，用CKM洗涤3次，室温静置1 h。随后样品用多聚赖氨酸(Poly-L-Lys，MW>300 kD，Sigma)粘附在载玻片上，在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 510 META)下观察，激发光波长为488 nm，记录花粉管细胞质中游离Ca² 的分布情况。

4. CaM的免疫荧光抗体标记

花粉管收集后悬浮于3%多聚甲醛中，抽气固定40 min，PME缓冲液(pH 6.9)洗涤三次，然后用1%纤维素酶和果胶酶混合酶解液于37℃暗处酶解15 min，随后用PME buffer洗涤三次，1%Triton X-100室温渗透45 min，PME缓冲液洗涤两次，PBS缓冲液(pH 7.4)洗一次，加一抗(1：10)室温孵育2.5 h，PBS洗涤一次后加二抗(1：100)室温孵育1 h，共聚焦显微镜下观察。