花粉管钙通道抑制后蛋白质组学研究

实验概要

本实验运用蛋白质组学技术手段对钙通道受抑制后花粉管中蛋白质表达模式进行研究，以期鉴定出与Ca² 调节花粉管生长相关的蛋白质，拓展对Ca² 在花粉管生长调节机制的认识。

主要设备

IPGphor II等电聚焦系统(Amersham Biosciences，Sweden)

ZipTipC18 (Millipore，MA，USA)

电喷雾离子化串联质谱 (ESI-MS/MS，Micromass，UK)

紫外分光光度计

实验材料

白皮松花粉

实验步骤

1. 材料培养

白皮松花粉，置于以下三种培养基，25℃条件下摇床(120rpm)暗培养72h。培养基中所含DMSO浓度低于1%，该浓度对于花粉萌发和花粉管生长无影响。

1) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ (CKM)

2) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 100µM Nif

3) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 250µM Nif

2. 花粉总蛋白的提取

培养的白皮松花粉，过滤后液氮研磨，再将其粉末溶解到10%TCA溶液中(丙酮配制，含0.07%巯基乙醇)，于-20℃下放置两小时。15000rpm离心10min，弃除上清液，再在三倍体积的丙酮中沉淀溶解(含0.07%巯基乙醇)，-20℃过夜。离心，弃除上清液，沉淀复溶到80%丙酮中(含0.07%巯基乙醇)，-20℃放置40min。离心弃除上清液，将沉淀风干后，用蛋白裂解液溶解(7M  urea，2M thiorea，4% (w/v)CHAPS，2%(V/V)ampholine pH 3.5-10，1%  DTT)，之后离心取上清，通过上述过程提取出来的蛋白质，在紫外分光光度计用Bradford法测定浓度(DU 640  Spectrophotometer，Beckman，USA)。

3. 双向电泳和图像分析

双向电泳实验主要依据《安玛西亚双向电泳手册》中的建议方法，并略加改进。等电聚焦之前将干胶条 (pH  3-10L，600px)溶解在450µl再水化液中(含8M urea，2% (w/v) CHAPS，0.5% (v/v) ampholine pH  3-10，0.002%bromophenol blue)，室温过夜。再水化溶液中含600µg蛋白质样品。等电聚焦实验使用IPGphor  II等电聚焦系统(Amersham Biosciences，Sweden)。等电聚焦使用下列参数：500V 1h，1000V  1h，然后将电压增加到8KV，升压模式选取“step by  step”，最后总电压伏时为64kVh。第二向电泳之前胶条先平衡两次，每次分别15min，第一次平衡液为：50 mM Tris-HCl (pH  8.8)，6M urea， 30%glycerol，2%SDS，0.002% bromophenol blue，1%DTT；第二次平衡液：50  mM Tris-HCl (pH 8.8)，6M urea， 30%glycerol，2%SDS，0.002% bromophenol  blue，2.5% idoacetamide。平衡后胶条放置在12.5%单一梯度聚丙烯酰胺凝胶上，用0.5%的琼脂糖封胶，每块胶40  mA，电极液保持在20℃跑数小时直到指示剂到达胶底部。凝胶用0.1%考马斯亮兰染色。

电泳后的凝胶用300 dpi扫描，图像用ImageMaster 2D Platinum 5.0分析(Amersham  Biosciences, Sweden)，表观分子量根据标准蛋白分子量来决定。同一处理的二维电泳重复3次，选取差异表达的蛋白质进行质谱分析。

4. 胶内酶切

将蛋白质斑点从胶上切下后，用50%乙腈和25mM NH₄HCO₃脱色，50 mM NH₄HCO₃处理在40℃下处理1h，水洗一次，10  mM DTT，60℃还原1h，还原后真空浓缩抽干，再用40 mM碘乙酰胺处理30min后水洗抽干，最后用10µl 20ng/µl  trypsin (modified sequencing grade，Sigma)  37℃酶切12-16h。肽段用0.1%三氟乙酸和50%乙腈提取，真空浓缩置于-40℃。

5. 蛋白质质谱鉴定

酶切后的蛋白质样品，用ZipTipC18 (Millipore，MA，USA)  脱盐后，用电喷雾离子化串联质谱测序列(ESI-MS/MS，Micromass，UK)。数据库检索使用MASCOT搜索引擎(www.matrixscience.com)，选择MSDB或NCBI数据库;  对于检索结果网站提供一个可信度分值(MOWSE Score)，如果实际值大或等于该值则错误率小于5%。当出现多个大于标准MOWSE  Score值的时候，一般选取得分最大的结果，同时还参考其匹配的肽段序列覆盖率(sequence  coverage)以及双向电泳胶上表观分子量和等电点。