Nif对白皮松花粉萌发和花粉管生长的调节

实验概要

本研究以白皮松花粉为实验材料，用不同浓度钙通道抑制剂Nif处理花粉和花粉管，结合Fluo-3AM荧光标记探讨Ca² 在白皮松花粉萌发和花粉管生长过程中的作用。此外运用Ca² 螯合剂及外加钙调素研究Ca² 包括细胞壁钙库对白皮松花粉萌发和花粉管生长作用。

主要试剂

1. 蔗糖、CaCl₂和硼酸均用双蒸水溶解，然后按所需浓度配制。

2. Nif购自Sigma，用无水DMSO溶解，配成10^-3mol/L的贮存液。

3. Fluo-3AM: Molecular Probes产品，用无水DMSO溶解配成10^-3mol/L溶液，于-20℃下保存。

4. 钙调素(CaM)购自Sigma，溶解配成7.5×10^-5mol/L贮存液。

5. 多聚赖氨酸(Poly-L-Lys MW>300kD，Sigma)。

主要设备

激光共聚焦显微镜(ZEISS，Meta550)

光学显微镜(Olympus)

实验材料

白皮松花粉。采集白皮松散粉之前的成熟小孢子叶球(雄球果)，置于室温下干燥48h，待散粉后，用无菌干燥小瓶收集成熟花粉，并密封保存于-20℃备用。

实验步骤

1. 配制含不同浓度Nif的培养基

1) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ (CKM)

2) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1µM Nif

3) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 10µM Nif

4) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 100µM Nif

5) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1mM Nif

6) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 2.5mM Nif

7) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 5mM Nif

称取花粉10mg，在室温下平衡30min，悬浮于10ml培养基中，25℃条件下摇床(120rpm)暗中培养。培养基中所含DMSO浓度低于1%，该浓度对于花粉萌发和花粉管生长无影响。

2. 外源细胞壁Ca² 及钙调素的作用

1) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ (CKM)

2) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1 mM EGTA

3) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1 mM EGTA漂洗白皮花粉10min，然后转移到CKM

4) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1 mM EGTA漂洗白皮花粉10min，然后转移到CKM 0.1µM CaM

3. 花粉萌发率和花粉管生长速度的测定

萌发率的测定：花粉培养36h后萌发，每隔12h统计花粉的萌发率。当花粉管的长度大于花粉粒的直径时，花粉粒被认为萌发。在光学显微镜下统计出萌发和未萌发的花粉粒数，根据公式：萌发率＝萌发的花粉数/总的花粉数×100%计算出萌发率。每个实验重复三次，每次所统计的花粉粒数目不少于300粒。

花粉管生长速率的测定：体外培养36h后，每隔12h取少量样品，用含有与培养基等浓度的蔗糖的3%多聚甲醛溶液固定30min。在光学显微镜下(Olympus)上选取已萌发的花粉进行测量。每个样品至少测定200个花粉管，计算出平均长度和标准差。用F检验和t检验分析处理与对照的差异显著性程度。

4. Fluo-3AM低温装载

        不同培养基中培养的花粉，加入1mM  Fluo-3至终浓度为10µM，混匀后放于4℃冰箱中轻微振荡2h后取出，用CKM离心洗涤3次，室温静置1h。将装载了Fluo-3AM的样品用多聚赖氨酸粘附在载玻片上，在激光共聚焦显微镜下用488nm对样品进行扫描，记录花粉管细胞质中Ca² 的分布情况。每个实验重复三次。