减数分裂制片技术

实验概要

1、了解植物生殖细胞的形成过程；
 

2、熟悉减数分裂各时期的特点，加深对减数分裂的认识；
 

3、掌握植物花粉母细胞的压片技术和方法。

实验原理

减数分裂（meiosis）,又称成熟分裂（maturation division）是在性母细胞成熟时，配子形成过程中所发生的一种特殊方式的有丝分裂。性母细胞（2n）连续进行两次核分裂（第一次分裂和第二次分裂），形成四个染色体数目减半的配子(n)。经过受精，雌雄配子（n）融合为合子，又恢复了体细胞染色体数目（2n）。确保了亲代与子代间染色体数目的恒定性，从而保证了物种相对的遗传稳定性。
 

在适当的时候采集植物的花蕾制备染色体标本就可在显微镜下观察到植物细胞的减数分裂。整个减数分裂可分为下列各个时期：
 

第一次分裂  

前期Ⅰ 减数分裂的特点之一就是前期Ⅰ特别长，而且又较复杂。通常根据细胞核内结构变化特征又将这一期分成五个时期，即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。
 

细线期（leptotene）：这是减数分裂的开始时期，染色质开始浓缩为细而长的丝状，首尾不分，且细线局部可见到念珠状颗粒，即染色粒。此时，虽然染色体已经复制为二个染色单体，但在显微镜下还看不出结构上的双重性。

偶线期(zygotene)：各同源染色体开始配对（pairing），出现联会现象。2n个染色体联会为n对染色体。染色体形态与细线期差别不大。在显微镜下不易与细线期分开，但可根据染色体分散状态及粗细变化判断其是靠近细线期还是趋于偶线期。

粗线期（pachytene）：二价体逐渐缩短变粗，同源染色体配对完毕，这种二价体包含了四条染色单体，又称四合体(tetrad)。此时，非姊妹染色单体间出现交换（crossing over）,造成遗传物质的重组。

双线期(diplotene)：配对的同源染色体进一步缩短变粗，由于同源染色体间发生过互换，开始分离而出现交叉（chiasmata）现象。此时染色体呈现扭花状。

终变期(diakinesis)：由于交叉端化（terminalization），染色体显著收缩变粗，并向核周边移动，在核内较均匀地分散，二价体往往呈X、O、V形态，核膜、核仁才开始消失。此时有利于染色体计数。

另外，玉米花粉母细胞在整个前期Ⅰ都具有较明显的核仁，这是前期的一个显著标志，进入中期,核膜、核仁才开始消失
。

中期Ⅰ 核膜、核仁才消失,各个二价体排列在赤道面上，纺锤体形成。双价体开始分离。此时也是鉴定染色体数目和形态的最好时期。

后期Ⅰ 由于纺锤丝的牵引，各个二价体分开，移向两极，每一极得到n条染色体，每一染色体含有两个染色单体。实现了染色体数减半（2n → n）。

末期Ⅰ 移到二极的染色体，解旋、松散变细，逐渐形成两个子核，核膜重新形成，胞质分裂，成为两个子细胞，称为二分体（dyad）。

中间期（interkinesis）  在第二次分裂开始之前，两个子细胞进入间期。但有的植物和大多数动物不经过间期，直接进入第二次分裂。间期的时间短，无DNA复制，故DNA含量没有变化。
 

第二次分裂
 

前期Ⅱ 染色体缩短变粗，开始清晰起来。每个染色体含有一个着丝粒和纵向排列的两条染色单体。前期快结束，染色体变得短粗、清晰可见，核膜消失。
 

中期Ⅱ 染色体排列在赤道面上，两条染色单体开始分裂。此时细胞的染色体数为n，每一染色体有两条染色单体。
 

后期Ⅱ 着丝点分裂为二，两条染色单体由纺锤丝分别拉向两极，每极含有n条染色体。
 

末期Ⅱ 染色体逐渐解旋，核膜重建，核仁重新形成，同时细胞质又分为两部分，各成为两个子细胞。
 

这样，一个花粉母细胞经过两次连续分裂形成四个子细胞，称四分体（tetrad）或四分孢子(tetraspore)。各细胞的核里的染色体只有最初细胞染色体的一半，即从2n减数为n。

主要试剂

Carnoy固定液（甲醇∶冰醋酸 = 3∶1）、醋酸洋红、45%醋酸等。

主要设备

显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片等。

实验材料

玉米雄花序（2n = 20）

实验步骤

1、采集玉米不同花期的雄花序用新配制的Carnoy固定液（甲醇∶冰醋酸 = 3∶1）固定18—24小时，经80%和70%酒精各半小时，保存于70%酒精中备用。这样处理的材料可保存使用2—3年。
 

2、取经过固定的雄花序，选取长0.5cm左右的小花，用解剖针或镊子挑出花药（每一朵小花有3个花药），置于载玻片上。

3、在花药上滴一滴醋酸洋红，然后用解剖针把每个花药截成几段，尽可能挤出花药中的花粉母细胞。

4、去除花药残渣，适当涂匀玻片，盖上盖玻片，垫一张滤纸，以大拇指均匀按压，注意，不要滑动盖玻片！吸去多余染液即可镜检。若高倍镜观察颜色太深，可在酒精灯火焰上过几遍，微烫，使细胞质透明，增大反差，注意不要拷过度！

5、显微镜下观察，寻找减数分裂各期图象，熟悉各时期特点。

注意事项

附：临时制片与永久制片

将做好的比较理想的片子，可以临时封片以保存一段时间，也可制成永久制片，以长期保存。

Ⅰ、临时制片：暂时封固良好的片子，可以用解剖针烧熔石蜡密封盖玻片四周，置低温下一般可保存数星期。
 

Ⅱ、永久制片：

1、将制好的片子有盖玻片的一面向下浸入95%酒精1：冰醋酸1的混合液中，从盖玻片脱落载玻片时算起1-2分钟。

2、轻取载、盖玻片，不使材料丢失并注意其位置，放入95%酒精2：正丁醇1的混合液中1-2分钟。

3，移入95%酒精1：正丁醇2的混合液中1-2分钟。

4，移入正丁醇中1-2分钟（至少两次）。

5，加拿大树胶（或中性树胶）封存。