实验概要
了解碱性磷酸酶的染色检测方法。
实验原理
本试验是一个酶组织化学试验,酶组织化学是在不破坏组织细胞的条件下,检测酶的存在,定位与活性的学科,即在酶的存在,分布及其用在显微镜下变成可见的。生命是有序的,包括时间的有序及其空间的有序。其中美的空间有序性在于其细胞组织结构的精确位置,各种酶的自己的位置保证了化学活动的有效进行。
酶的定位方法必须准确,其显示方法必须具有高度的特异性,使酶本身具有可见性,这是一种直接的方法,目前主要有免疫荧光化学法,该法敏感性高,速度快,但成本高。如果有相同的抗原决定簇时,则会有交叉反应。方法成熟,使用广泛的还是经典的组织化学方法。下面以碱性磷酸酶的显示方法来学习经典酶组织化学的理论及操作。经典酶组织化学不是显示酶本身,常采用的方法是:在一定条件下,使细胞中的酶作用于酶的底物,使其产物在原地进行捕捉、沉淀转化为有色产物。碱性磷酸酶(AKP)的显示方法最早由Gomeri(1939)提出,现在这种方法称为Gomeri法。碱性磷酸酶是指磷酸单酯酶Ⅰ,它能在pH8.6~10.0的最适条件下分解磷酸单酯,对于与磷酸相接的醇基没有特异性,Gomeri法是让该酶在碱性条件下,分解甘油磷酸钠,产生磷酸根。
在孵育液中加入CaCl2,分解产生的磷酸根离子立即被Ca2 原位捕捉形成沉淀。
HPO2-- Ca2 →→CaHPO4 ↓(无色沉淀)
因出现的是无色沉淀,故还不能在光镜下观察到,尚需转化为有色沉淀,先让制片与Co(NO3)2反应生成磷酸钴:
CaHPO4 Co(NO3)2 →→CoHPO4 ↓(无色沉淀) Ca(NO3)2
再让它与硫化铵反应生成黑色的硫化钴沉淀。
CoHPO4 (NH4)2S→→(NH4)2HPO4 CoS ↓(黑色沉淀)
我们可以在显微镜下观察到黑色沉淀的位置,由于以上的这些操作都是在原位进行的,可以认为黑色沉淀的位置就是酶所在的位置,这类方法是让酶作用于底物而将酶显示出来。因此制作酶组织切片的时候不能使酶失活,还要尽量避免酶所需的反应的产物扩散,否则不会得到正确的结果。
主要试剂
1. 二甲苯
2. 无水乙醇
3. 95%乙醇
4. 90%乙醇
5. 70%乙醇
6. 30%乙醇
7. 3% 甘油磷酸钠
8. 2%巴比妥液
9. 2% 氯化钙
10. 2%硫酸镁
11. 2%硫化铵(45ml蒸馏水 硫化铵6-7滴)
12. 2%硝酸钴
13. AKP作用液:
3%甘油磷酸钠 10ml
2%巴比妥液 10ml
2%氯化钙 2 ml
2%硫酸镁 1 ml
蒸馏水 20 ml
主要设备
1. 立式染缸 12个
2. 镊子 2把
3. 量筒 25ml 1个
10ml 1个
4. 恒温水浴(37°C) 1个
5. 沸水浴 1个
6. 电炉 1个
实验材料
组织制备
1. 取材:取动物肾、小肠等大块组织,大小约2-3mm
2. 固定:将取下的材料迅速在冷丙酮中固定24小时(一直在4°C中进行),中间换冷丙酮4次
3. 包埋:将固定好的材料,用纯酒精脱水30分钟(中间交换一次),二甲苯透明(20分钟),用快速法把材料包埋于石蜡中(用低熔点的石蜡)
4. 切片:切片5~6µ,在37°C以下的温水中展片,将蜡片粘于涂有蛋白胶的载波片上
5. 把切片置于37°C温箱种干燥小时
6. 将切片置于4°C的冰箱,直至试验前才取出
实验步骤
1. 每人取已粘好烘干的鼠肾切片两块,放入二甲苯(一)→→二甲苯(二)(各3-4分钟)的染缸中进行脱蜡,再经100%乙醇(一)→→100%乙醇(二)→→95%乙醇→→90%乙醇→→70%乙醇→→30%乙醇→→水。每级各一分钟,在移切片时,用镊子夹住切片震荡并提起,放下反复几次,在移入下一染缸边缘前稍停留,让溶液滴净后,再入下一染缸,以免把上一染缸溶液过多带入下一染缸,而影响切片质量;
2. 将其中一块切片以蜡笔作一标记(用作对照组切片),放入沸水中煮沸5分钟;
3. 将两块切片均放入AKP作用液中孵育30-60分钟,作用液要事先预热到37°C,水浴中进行;
4. 取出切片在蒸馏水中洗涤;
5. 放入硝酸钴溶液2-3分钟;
6. 蒸馏水冲洗干净,否则切片易被污染,影响定位;
7. 切片浸入硫化铵中2-3分钟;
8. 蒸馏水冲洗干净;
9. 经各级酒精脱水。即30%乙醇→→70%乙醇→→90%乙醇→→950%乙醇→→100%乙醇(二)→→100%乙醇(一),各级一分钟。
注意事项
观察结果:
在显微镜下观察,细胞中有黑色沉淀存在的地方,就表明有酶的存在。煮沸的对照切片无黑色沉淀。
近日,中国科学院大连化学物理研究所研究员李国辉团队与中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员杨巍维团队、广州大学教授王雄军、复旦大学附属中山医院教授李全林等合作,揭示了代谢酶果糖1,6-二磷酸酶1(F......
类朊蛋白(Prion-likeproteins)是指细胞内能够以自身为模板,聚合成为淀粉样高聚物(amyloid-likeaggregates)的正常蛋白。一般地,氨基酸序列决定了一个蛋白质只存在一种......
浙江大学基础医学院柯越海课题组与附属邵逸夫医院曹倩团队合作在JExpMed杂志上发表研究论文"PhosphataseShp2exacerbatesintestinalinflammation......
生物和人类都可能面对低氧的胁迫。在高原或特殊环境生活的生物和人类都发展出一系列适应低氧环境的对策,比如提高氧气的运输效率或增强氧气的利用效率。肿瘤细胞也会造成局部缺氧状态。大量的研究证明低氧诱导因子(......
磷酸酶包括酸性和碱性两种。医生可通过测试体内这两种酶确定检测癌症等特定疾病。在之前的药性研究中,磷酸酶一直被认为不具有成药性(undruggable),但近日Cell一项研究称,科学家们开发出了一种可......
南京大学生命科学学院、医药生物技术国家重点实验室徐强教授、孙洋教授研究团队在NLRP3炎症小体调控领域取得重要进展,发现了磷酸酶SHP2转位线粒体与ANT1相互作用介导了NLRP3炎症小体稳态精细调控......
科学家们最近发现了影响肿瘤生长的一个新机制。肿瘤内部缺氧环境不仅能够刺激增殖还会影响PHD2这种蛋白使其无法发挥“癌细胞杀手”的功能。研究人员发现想要重新恢复PHD2的功能可以通过阻断PP2A/B55......
来自上海交通大学、加州大学圣地亚哥分校的研究人员在新研究中证实,Shp2和Pten在骨髓增生中发挥相互拮抗作用,却协同作用促进了哺乳动物红细胞生成。这一重要的研究发现发布在10月12日的《美国国家科学......
碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)在生物界的分布很广,动物、植物、微生物中均广泛存在L提纯的AKP常被应用于对核酸等的研究,是基因工程常用的工具酶,也是酶标免疫测定技术的常用......
本方法适用于酸水解后柱前衍生,用自动氨基酸分析仪测定样品中水解氨基酸、游离氨基酸以及不常见的氨基酸。......