发布时间:2019-04-30 21:57 原文链接: 酵母的高效转化

酵母的高效转化

1.接种5ml液体YPAD10ml SC30℃下振荡培养过夜。

2.计数过夜培养物细胞密度,以最终5×106/ml的细胞密度接种50ml YPAD培养液。

3.30℃,200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml,通常需要35小时,该培养物的细胞足够供十次转化用。

4.50ml无菌离心管以3000g2500r/min)离心5分钟,收获细胞。

5.弃培养液,把细胞悬浮在25ml无菌水中,再同上离心。

6.弃水,把细胞悬浮在1ml100mmol/L醋酸锂中,转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。

7.高速离心5秒钟沉淀细胞,用微量移液器吸出醋酸锂。

8.悬浮细胞到最终500μl体积其中大约含400μl100mmol/L醋酸锂。

9.1ml单链载体DNA样品煮沸5分钟,快速在冰水中冷却。

10.  振荡细胞悬浮液,取50μl样品加到标记的离心管中,离心沉淀细胞,用微量取样器除去醋酸锂。

11.  基本“转化混合液”由下列成分组成,小心按下列顺序如下:

240μl    PEG50% w/v

36μl     1.0mol/L 醋酸锂

25μl     单链载体DNA2.0mg/ml

50μl     水和质粒DNA0.110μg

12.  剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀,通常需要1分钟左右。

13.  30℃保温30分钟。

14.  42℃水浴中热激2025分钟。

15.  60008000r/min离心15秒,用微量移液器除去转化混合液。

16.  0.21.0ml无菌水加到每个反应管中,用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。

17.  用等份的200μl转化混合液涂选择平板。