摘要 目的：探讨动态观测HCV感染指标及序列变异的意义。方法：ELISA方法检测抗-HCV-IgG、IgM，RT-PCR方法检测HCV rNA， PCR产物直接测序。结果：6例感染HCV的血透析患者抗-HCV-IgG的表现类型分为持续阴性及持续阳性两种；抗-HCV-IgM有四种表现：一过性阳性、间隙性阳性、持续阴性及持续阳性；HCV rNA检测多为间断阳性；同一患者不同时期感染的HCV株E2/NS1区序列间存在差别，且HVR1区基因变异与有无抗体生成有关。结论：抗-HCV-IgG、IgM、HCV rNA的动态检测对说明体内有无病毒存在，疾病有无慢性化倾向有重要的意义。HCV e2/NS1区基因变异对提示病毒逃避机体免疫清除，疾病向慢性化方向发展有指导意义。
关键词：肝炎病毒 丙型 感染指标 序列变异
为了研究结合病毒基因组序列的变化探讨动态检测抗-HCV-IgG、IgM及HCV rNA的临床意义及其间的相互关系，我们选择了HCV感染率相对较高的血液透析人群作为研究对象。在1995年3月对一批长期、多次进行血液透析的患者进行了筛选，确定了6例HCV感染者作为追踪对象，在随后1年半的时间里，对这些患者进行了随访，对其血清中HCV感染指标(抗-HCV-IgG、IgM、HCV rNA)以及HCV E2/NS1区的cDNA序列进行了动态观察，以了解HCV的感染及变异情况，探讨相应的临床意义。
材料与方法
一、血清标本
6例血液透析患者(编号1～6)血清由上海医科大学附属中山医院血液透析中心提供，其中男性3例，女性3例，年龄25～41岁，平均33岁。
二、抗-HCV-IgG检测
试剂盒为上海长征公司产品，操作按试剂盒说明书进行。
三、抗-HCV-IgM检测
试剂盒由第二军医大学微生物教研室生产(4°C以下稳定半年)，操作按试剂盒说明书进行。
四、HCV RNA的提取
用异硫氰酸胍酚氯仿法［1］。
五、HCV RNA的逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)检测
采用RT-Nested-PCR进行检测。寡核苷酸引物根据中国人HCV基因组序列设计［2］，由复旦大学合成。外引物1:5′CTACTCCGGATCCCAC aAGC3′(核苷酸位置1009-1028)；外引物2：5′GGGCTCGGAGTGAAGCAATA3′(核苷酸位置1519-1538)；内引物1：5′ATTCCATGGTGG gGAACTGG3′(核苷酸位置10851104)；内引物2：5′GCAATACACTGGACCACACA3′(核苷酸位置15041523)。HCV cDNA的合成：将提取的RNA溶于20μl逆转录反应混合液中，内含5×逆转录反应缓冲液4μl，0.1mol/L dTT 2μl， 10pmol外引物2 1μl，10mmol/L dNTP各1μl，70°C 5分钟后，加入1μl100U鼠源逆转录酶(MMLV)及石蜡油2滴，于37°C反应1小时，95°C变性5分钟，冷却。HCV cDNA的扩增：第1轮PCR反应总体积50μl，含20μl逆转录反应产物及30μl反应扩增液，内含10×反应缓冲液5μl，15mmol/L mgCl2 5μl，10pmol外引物11μl,Taq DNA酶合酶1U，于DNA扩增仪上按94°C1分钟，54°C1.5分钟，72°C分钟行35个循环。第2轮PCR反应总体积55μl，内含5μl第1轮PCR反应产物及10×反应缓冲液5μl，15mmol/L mgCl25μl，10pmol内引物1和内引物2各1μl，10mmol/L dNTP各1μl及Taq dNA聚合酶1U，加入石蜡油2滴，按94°C 1分钟，60°C 1分钟，72°C2分钟的条件行35个循环。结果观察：取15μl第2轮PCR扩增产物在2%琼脂糖凝糖胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外检测仪上观察DNA带。
六、DNA序列测定
将第2轮PCR产物在0.7%低熔点琼脂糖凝胶中电泳，回收DNA，引物5′端的γ32PATP标记及测序反应均按操作说明书进行。
结果
一、6例血液透析患者血清抗-HCV-IgG、IgM、HCV rNA动态检测结果
动态观察6例血液透析患者血清抗HCV-IgG、IgM、HCV RNA检测结果如下：病例1：共收集血清6次，抗HCVIgG、IgM检测均为阴性，HCV rNA5次阳性(1995年3、10、1996年1、4、6月)；病例2：共收集血清3次，抗HCVIgG检测均为阳性，抗HCVIgM检测均为阴性，HCV rNA均为阳性；病例3：共收集血清6次，抗HCVIgG检测均为阳性，抗-HCV-IgM检测1次阳性(1995年3月)，HCV rNA3次阳性(1995年3月、1996年1、6月)；病例4：共收集血清6次，抗HCVIgG、IgM检测均为阳性，HCV rNA 4次阳性(1995年3月，1996年1、4、6月)；病例5：共收集血清6次，抗HCVIgG检测均为阳性，抗HCVIgM检测2次阳性(1995年3月及1996年1月)，HCV rNA3次阳性(1995年3月、1996年1月、6月)；病例6：共收集血清5次，抗HCVIgG检测均为阳性，抗HCVIgM检测均为阴性，HCV rNA3次阳性(1995年3月、1996年1、6月)。6例感染HCV的血液透析患者抗HCVIgG的表现类型分为持续阴性及持续阳性两种；抗HCVIgM有四种表现，分别为：一过性阳性、间隙性阳性、持续阴性及持续阳性；HCV rNA检测多为间断阳性。