5种方法鉴定耐甲氧西林葡萄球菌的实验比较

 我们采用Etest和聚合酶链反应(PCR)等5种方法对200株葡萄球菌的甲氧西林特性进行研究，分析各方法的准确性，探讨建立鉴定耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的有效途径，指导临床诊断与治疗。

　　1　材料与方法

　　1.1　菌株来源　200株葡萄球菌分离株由我所与广州市红十字会医院提供，其种类经Vitek System鉴定，质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923。

　　1.2　药敏试剂　BBL的苯唑青霉素药敏纸片，含量为1 μg/片。Etest甲氧苯青霉素纸条为AB BIODISK产品，浓度为0.016～256 μg/ml。GPS-SB专用药敏卡由生物-梅里埃公司生产。

　　1.3　引物　针对MecA基因的引物序列参照Murakami［1］的报道，由我所合成并纯化。

　　1.4　主要仪器　PE9600型PCR仪，Vitek-60，UVP GDS8000型凝胶成像分析系统。

　　1.5　试验方法　Vitek System、K-B法、Etest、琼脂筛选法均根据操作说明与NCCLS标准进行，其中琼脂筛选试验中氯化钠浓度为40 g/L，苯唑青霉素为4 μg/ml。聚合酶链反应中以酚、氯仿法提取DNA，基因扩增条件同Murakami［1］的设计，产物检测使用含溴乙锭的琼脂糖凝胶(15 g/L)进行电泳，紫外灯下见310 bp扩增片段者为阳性。

　　2　结果

　　2.1　葡萄球菌分类与来源　经Vitek系统鉴定，金黄色葡萄球菌(SA)为136株，凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)占64株，其中表皮葡萄球菌有21株，另外，21株为腐生、赛氏、溶血、模仿、华纳五种葡萄球菌。从呼吸道分离的细菌占130株，泌尿生殖系统分离株为52，伤口等其它部位占18株。

　　2.2　甲氧西林药敏试验　琼脂筛选法、Etest、Vitek System 3种方法筛选的耐甲氧西林葡萄球菌分别为118、117和108株。K-B法为120株耐药，7株中介度，73株敏感。158株细菌可检出MecA基因，仅42株为阴性PCR结果，参见表1。

　2.3　对比研究　以琼脂筛选法为参考标准，Etest、K-B、Vitek System三者鉴定耐甲氧西林葡萄球菌的符合率分为117/118，118/120和108/118。而聚合酶链反应的准确性仅为116/158。

表1　5种方法鉴定耐甲氧西林药敏的结果

　　sA：金黄色葡萄球菌　CNS：凝固酶阴性葡萄球菌，S：敏感，R：耐药，I：中介度。

  　3　讨论

　　由于耐甲氧西林葡萄球菌具有表型的不稳定性与内部亚群的不均一性［2］，故目前尚无理想方法可全部筛选出耐药菌，各种方法的结果存在差异。我们在基本相同的条件下同步进行琼脂筛选，Etest和K-B 3种方法检测200株葡萄球菌，其结果基本一致。定性的K-B法虽易采用，但影响因素较多，需严格掌握实验条件，目前仅作为初步筛选的手段，对可疑菌株需改用其它方法。Etest法结合了扩散法与稀释法的优点，以连续浓度梯度方式测定抗生素MIC值，对葡萄球菌耐药株的检出率接近100%，由于价格昂贵，应用受到限制。

　　Vitek System采用微量稀释法原理，以生长曲线变化来快速判读受试菌的敏感性，目前对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测率超过95%。本文资料显示，Vitek系统法的总体检出率为91.5%，耐药菌漏诊率达8.5%，其中凝固酶阴性葡萄球菌居多，提示根据Vitek系统快速鉴定结果作出该菌敏感性的报告需慎重。

　　近年来有聚合酶链反应检测葡萄球菌耐药基因以筛选耐药菌株的报道［3］。本文对200株细菌进行MecA基因扩增，有158株为阳性结果，其检出率为79%，与上述培养法有较大差异。由于多数葡萄球菌内存在MecA基因，少数耐药菌缺失该基因，且耐药基因的检出并非等同于细菌耐药性，因此现阶段聚合酶链反应在筛选耐甲氧西林葡萄球菌中的作用有限。