发布时间:2019-05-20 19:32 原文链接: 与DNA结合蛋白相作用的启动子序列的鉴定

番茄子叶细胞核的分离提取为例子进行实验

步骤27须在4℃下使用高压灭菌过的设备进行。

1.将番茄种子种在灭菌的水饱和滤纸上,置于小盆内,用薄膜封口后,培养7天。用刀片切下番茄子叶后收集备用。

2.4050g新鲜组织放入300ml匀浆缓冲液,用韦林氏搅切器先1×4秒而后6×1秒。

3.过滤匀浆混合液,使其透过漏斗上的4层厚纱布及纱布下按孔径递减次序放置的3Nitex尼龙筛网(300μm100μm52μm),汇入大烧杯中。全部匀浆物均滤完后把纱布集中在一起,将纱布上的滤液压入尼龙网,并使其经漏斗流入烧杯中。切勿将滤液压出尼龙网,亦不可使用抽滤,让滤液靠重力作用下流。

4.将每批滤出的匀浆倒入500ml离心瓶中,用Sorvall GS3转头5000r/min4225g),4℃离心20分钟。

5.吸去上清,然后将核粗提沉淀物用大口径塑料巴斯德吸管温和地反复吹吸,使沉淀悬浮于匀浆缓冲液中。将重悬起的沉淀转入50ml离心管中,用匀浆缓冲液调节体积至约40ml

6.4℃用Sorvall SS34转头4000r/min1912g)离心10分钟,再次沉淀细胞核。重复步骤56三次,分别在3500r/min离心10分钟,8分钟和6分钟。最后一次离心后,尽可能洗净匀浆缓冲液。

7.将核悬浮于核悬浮缓冲液中,按每50g植物组织加0.5ml核悬浮缓冲液。用液氮冷冻,保存于-80℃。若核蛋白抽提即将进行,可不必将核冷冻起来。

核抽提物的制备

1.将细胞核置于冰上解冻,精确测定核悬浮液的体积。

2.加入核裂解缓冲液,使NaCl终浓度为0.47 mol/L(即,每毫升核悬浮加入182μl核裂解液)。

3.将核悬浮液置于摇床上,4℃温和摇动30分钟。

4.4℃微量离心20分钟沉淀染色质。

5.小心移出上清,避免搅起胶状的含DNA的沉淀,以使抽提液中避免含有此类杂质。

6.4℃透析上清34小时,中间换几次透析液。

7.将透析液用液氮冷冻,再置于冰上解冻,4℃微量离心或用Sorvall SS34转头10 000r/min12 000g)离心15分钟,弃沉淀,保留上清。此步骤是为了将其余可能在浓缩步骤中阻塞微量浓缩器的蛋白质沉淀除去。

8.CENTRICONTM10微量浓缩器浓缩上清,以使提取液中蛋白质的终浓度为13mg/ml。可以溶菌酶为标准物用Bio-Rad Bradford-based蛋白质分析试剂盒来测定蛋白质浓度。经验表明,要达到上述浓度,至少需要浓缩23次。

9.留出待作迁移分析的核抽提物,将剩余部分用液氮或干冰冷冻,贮于-80℃备用。

DNA片段的标记

l      聚丙烯酰胺凝胶的制备

1.安装凝胶装置并洗净玻璃板。

2.配制4%丙稀酰胺凝胶液,将以下成分混合:

丙稀酰胺/双丙稀酰胺(291                         4ml

TBE10×)                                         3ml

APS10%)                                       200μl

TEMED                                             40μl

制备厚1mm的凝胶,并保证上样孔可容纳25μl样品。凝胶聚合约需1小时,制好后,使用前可于室温放置1天。

 

l      探针的标记

1.按下表顺序将下列试剂加入1.5ml微量离心管中:

EcoR I酶解的质粒DNA1μg或约800fmol末端)           2.5μl

Sequerase®缓冲液(5×)                                 2.0μl

[α-32P]dATP6000 Ci/mmol                             3.0μl

二硫苏糖醇(0.1mol/L                                  1.0μl

双蒸去离子水(ddH2O                                  0.5μl

Sequerase®酶(用4Sequerase®稀释缓冲液稀释)          1.0μl

总体积:                                                10μl

2.室温放置15分钟。

3.加入0.5μl dNTP混合物,充分混匀。

4.室温放置15分钟。

5.加入90μl 0.35mol/L的乙酸钠并充分吹吸混匀以终止反应。

 

l      测定掺入的放射性活度

1.5μl标记反应混合物移至一新管中。将2μl此混合物点加到DE81滤膜上,再将该滤膜浸入盛有约20ml 0.5mol/L磷酸钠(pH7.0)的烧杯中。再取第二张滤膜重复上述操作。

2.将烧杯置于平面振荡器上,使溶液温和振荡5分钟,将缓冲液倒入放射性废弃物中。

3.用新缓冲液重复两次清洗步骤。

4.用双蒸水漂洗滤膜5分钟,再用双蒸水重复漂洗两次。

5.95%乙醇洗滤膜5分钟。

6.使滤膜完全干燥,再将每一张滤膜移入闪烁计数管,加入闪烁混合物,计数。

7.计算理论掺入的最大比率。计算方法如下:1)每个反应可标记400fmol质粒DNA2)标记反应在EcoR I酶切的质粒DNA两端进行,每个末端可掺入两个脱氧腺苷磷酸残基。3)因此,每400fmol质粒DNA可结合1600fmol标记核苷酸。4)标记核苷酸的比活性是6000 Ci/mmol,即13 000cpm/fmol5)因此,理论最大掺入值为每400fmol质粒DNA 13 000cpm×1600fmol2.08×107cpm或每400fmol片段1.04×107cpm。注意,仅掺入量的一半包含在待测片段中。随后的酶解反应会释放出一端标记的待测DNA片段和一端标记的载体DNA

 

l      标记探针的分离

1.95μl/氯仿/异戊醇(25241)于剩余的95μl标记混合物中。充分混匀。

2.室温离心35分钟以分离酚相与水相。

3.小心取85μl上层水相于另一干净离心管中,将盛有酚相的离心管弃入放射性废弃物中。加入200μl 95%乙醇于水相中,旋紧管盖后,涡旋混匀。

4.将离心管于碎干冰上放置1520分钟,然后离心20分钟。

5.用移液器,小心将含乙醇的上清弃于放射性废弃物中。加入600μl 80%乙醇洗涤沉淀,离心12分钟,用移液器弃去乙醇。

6.用真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀23分钟。

7.将沉淀用20μl 1×Sequenase®缓冲液重悬,再加入0.5μl 10units/μlPst I将标记的DNA片段从载体DNA上切下。37℃温育3060分钟。

8.加入2.5μlEDTA 10×凝胶染液于酶解混合物中。向先制好4%丙稀酰胺凝胶中上样,然后用1×TBE缓冲液在大约10V/cm电压下电泳约2.5小时。电泳时间取决于标记片段的大小。目的是为了很好地分离标记片段与质粒载体,但切勿使目的片段跑出胶外。

9.电泳后,小心地把凝胶用保险膜包裹好,对X光片曝光510分钟。使用Sharpie®或其他防水标记物标记胶片及凝胶边缘,以便胶片显像之后可根据标记使凝胶与胶片重合。

10.  切下凝胶上对应地标记DNA的条带,置于1.5ml离心管中。4℃下用300μl洗脱缓冲液温育凝胶薄片过夜,以洗脱DNA。将洗缓冲液移取至另一干净的离心管中。再向凝胶管中加入250μl洗脱缓冲液。-80℃冷冻再解冻,然后将洗脱缓冲液取出与前一次洗脱的溶液合并。将合并后的洗脱液离心10分钟以沉淀聚丙稀酰胺的小碎片。移取上清至另一干净离心管中,用2倍体积的95%乙醇沉淀DNA,碎干冰上放置20分钟,然后离心20分钟。弃上清,用约500μl 80%乙醇洗沉淀。用真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀23分钟。

11.  将纯化的DNA片段重悬于20μl片段重悬缓冲液中。取一小等份计数测定回收的片段fmol数。一般情况下,大约可以回收原初标记量的50%。从凝胶中洗脱的效率大约为80%,但是收率会因DNA片段的大小而异。纯化的DNA片段可在4℃最多可以保存2个星期。

迁移率变动分析法

l      聚丙烯酰胺凝胶的制备

1.组装电泳装置并洗净玻璃板。

2.按下表配制4%非变性丙稀酰按凝胶溶液:

丙稀酰按/双丙稀酰按(291                   4ml

TBE10×)                                   3ml

APS10%)                                 200μl

TEMED                                       40μl

可灌制成11.5mm厚的凝胶。凝胶聚合约需1小时,使用前可于室温下保存1天。

 

l      DNA-蛋白质结合反应

1.10mg/mlpoly(dI-dC)poly(dI-dC)贮液用无菌双蒸馏水稀释成终浓度6μg/μl。将6μg/μlpoly(dI-dC)poly(dI-dC)溶液与32mmol/LpH8.0)的EDTA等体积混合,配制成工作溶液。用片段重悬缓冲液将32P标记的DNA片段稀释至终浓度2fmol/μl

2.对于标准DNA-蛋白质结合反应,按下表顺序将下列试剂加入1.5ml微量离心管:

32P-标记DNA片段(2fmol/μl              &