ELISA方法快速检测肉制品中的沙门氏菌

一、实验目的

        掌握ELISA方法快速检测肉及肉制品中的沙门氏菌的具体方法及操作步骤。

        二、实验原理

        酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的固相酶免疫测定方法,是在放射免疫分析理论的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好,所用试剂稳定、易保存,试验操作简便,结果判断客观等特点常用的ELISA测定方法有:根据检测目的和操作步骤不同, ELISA有3种基本方法。(1)双抗体(原)夹心法 (2)间接法 (3)竞争法。其中竞争法由于具有反应重复性与完成性好的特点,它是目前使用较广泛的测定方法。

        三、实验材料

        1．包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（pH9.6 , 0.1M） Na2CO3.10H2O 11.45g   NaHCO3 5.04g NaN3 0.2g 蒸馏水加至1000mL

        2．稀释液 ： PBS(Ph7.4, 0.15M ) 0.2M Na2HPO4 40.5 mL 0.2M NaH2PO4 mL NaCl 8.2g

        3．Tween 20 0.5 mL 蒸馏水加至1000mL

        4．洗涤液：NaCl -Tween NaCl 8.5g Tween 20 0.5 mL蒸馏水加至1000mL

        5．底物溶液：磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0） 0.1M柠檬酸 24.3 mL 0.2M磷酸氢二钠25.7mL蒸馏水加至50mL 邻苯二胺 40 mg，溶解后避光保存。临用前加入30% H2O2 0.15 mL

        6．封闭液：0.2% BSA溶液

        7．沙门氏菌血清

        8．辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体

        9．终止剂 ：2M 硫酸

        10．ELISA板

        11．酶标检测仪

        12．移液枪

        13．人工污染沙门氏菌的香肠制品一份。

        四、实验步骤

        (1)样品前增菌18-24h.

        (2)样品包被:取样品100μｌ/孔包被酶联板4℃过夜，洗板3次。

        (3)封闭:BSA 200μｌ/孔,37℃孵育1ｈ，洗板3次。

        (4)加入一抗100μｌ/孔，洗板3次。

        (5)加入酶标二抗100μｌ/孔37℃孵育1ｈ，洗板3次。

        (6)加入底物，37℃孵育30ｍｉｎ。

        (7)加入终止剂。

        (8)读取结果。

        五、实验结果

        通过酶标检测仪读数判定检测结果。

        六、思考题

        为什么ELISA反应总是需要一定时间的孵育？

        实验二 PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌

        一、实验目的

        掌握PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌具体方法及操作步骤。

        二、实验原理

        聚合酶链反应(polymerase chain reaction ) 简称PCR，是一种体外酶促合成反应，扩增特定DNA片断的方法。该技术于1985年由美国的Kary Mullis等人首创并由美国GETUS公司开发。其原理是：在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反应体系中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片断进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火(复性)、延伸等三步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。由于每一周期产生的DNA片断均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数形式增加，从而实现信号的放大。

        本实验以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶为靶基因进行检测。

        三、实验材料

        1．菌种：Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)－26003-21

        2．乳制品：全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超市。

        3．培养基：营养肉汤培养基

        4．化学试剂：10xPCR buffer、dNTPs、TaKaRa Taq、DNA Marker DL2000，

        5．引物： 正向引物：GCGATTGATGGTGATACGGTT                    

        反向引物：AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC

        6．实验仪器：PCR仪、DXY-33A型电泳仪、UVIpro凝胶成像系统

        四、实验步骤

        1.将已人工污染的乳品25ml接入225ml营养肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜

        2.取1ml培养液于1.5ml离心管中，11000rpm，离心1分钟，弃去上清液

        3.用灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次，再用100ul灭菌纯水溶解沉淀物

        4.将菌悬液于沸水浴中煮沸10分钟，11000rpm，离心1分钟，取上清液，备用

        5.PCR反应体系：总反应体系50ul。包括5ul 10XPCR buffer ，4ul dNTPs混合物，0.5ul 40umol正向引物，0.5ul40umol反向引物，0.25ul（5U/ul）Taq酶，模板2ul，水37.75ul。

        6.PCR扩增程序：PCR反应采用冷启动。94℃预变性4分钟，再按94℃1分钟－52℃0.5分钟－72℃1.5分钟进行35个循环，最后72℃延伸3.5分钟。

        7.电泳检测：取5ul PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并成像。