实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化

实时荧光定量PCR以其精确、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。但是定量PCR是对精确性要求很高的实验，不仅要求在实验前有比较完整的实验设计方案，而且实验的条件对实验结果的影响也非常大。这些都是很多老师与学生非常关心的问题，下面分别从这两个方面来对定量PCR实验做一些阐述。 
定量PCR实验步骤（以mRNA为例）： 
1.设计实验方案：例如对样品、实验组和对照组的一个实验流程设计 
2.引物和探针的设计和合成 
3.抽提RNA，测定提取的RNA的浓度 
4.反转录PCR 
5.定量PCR 
6.数据分析 
在进行定量PCR实验的过程中，PCR的扩增效率是一个非常重要的影响因素，因为定量PCR原理的理论方程是基于扩增效率最大值1，因此高的扩增效率能保证定量PCR实验的精确性及重复性，影响PCR扩增效率主要有以下几个方面：1，扩增子的长度；2，扩增子的GC含量；3，扩增子、引物和探针的二级结构；4，PCR反应各组分的浓度；5，RNA或者cDNA的纯度。 
进行定量PCR实验时，必须设计好引物和探针，除了能获得高的扩增效率外，对PCR扩增的特异性、消除DNA的扩增及提高扩增的灵敏度都有很大的影响。下图就是使用不同的引物和探针对18SRNA进行定量PCR的荧光曲线图（反应条件和模板都相同）。

引物设计原则：
1.上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守。
2.上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
3.确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4.避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。5．跨外显子设计引物，用于区别或消除DNA的扩增。

探针设计的基本原则：
1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
3. 确保探针中GC含量在30-80%。
4. 避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基
5. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时， 也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的 上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基。
7. 避免探针与引物之间形成二级结构。
8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。

实时定量PCR体系的优化 
1.基本参数的优化： 
1）MgCl2的浓度：在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossingpoint)值（指PCR达到指数扩增期时，产生一定的荧光高于背景并为仪器所识别时的循环数），较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的浓度选择应慎重。一般来说，对以DNA或cDNA为模板的PCR反应，应选择2－5mM浓度的MgCl2，对以mRNA为模板的RT－PCR而言，则应选择的浓度为4－8mM。 
2）模板的浓度：如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。一般而言，使Cp位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Cp小于15则应选择较低的模板深度。对于Cp值的确定，经验上是SYBRGreenI探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。 
2.使用SYBRGreenI测定DNA时的条件优化： 
1）MgCl2的浓度：大多数引物－模板对其的要求是2－4mM。 
2）模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。DNA在50ng-5pg之间选择，质粒DNA在106拷贝数左右。 
3）引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应，0.3uM是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.1－1.0uM之间进行选择，直至达到满意的结果。 
4）退火温度：首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃内进行选择。一般的，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有一定的差距。 
3.用SYBRGreenI进行一步法RT－PCR的条件优化： 
1）MgCl2的浓度：不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在4－8mM之间选择。 
2）模板的浓度：RT－PCR实验既可以选用总RNA，又可以选用mRNA，其浓度应在1pg-1ug之间选择。对于低模板浓度，可以增加适量的MS2或用alternativeRNA作为载体进行测定。 
3）对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。 
4.杂交探针测定DNA 
1）MgCl2的浓度：在2－4mM的基础上加0.5－1.0mM，但是不要超过2.0mM。 
2）杂交探针的浓度：初次实验每个探针用0.2uM，如果信号强度达不到要求，可以增加至0.4uM。 
3）对照设置：每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。每次实验都要设阳性对照。 
4）其它的条件同SYBRGreenI。 
5.用杂交探针进行实时定量RT－PCR： 
1）MgCl2的浓度：在4－8mM之间进行选择。 
2）杂交探针的浓度：初实验用0.2uM，如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。 
3）模板浓度设置：优化的扩增须进行一系列稀释度的实验，在条件有困难的情况下，至少要进行两个稀释度的测定。选用1pg-1ug的总RNA或是mRNA，若是模板的浓度过小（小于10ng/ul），则可加入MS2或alternativeRNA作为载体。 
4）对照设置：每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。 
6.关于杂交探针的评价：在使用杂交探针进行实验时，必须注意防止探针－引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。引物－探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3’末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，导致反应的效率下降。探针其本身能同目的基因相结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，为了防止发生这种现象，通常是将其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是没有磷酸化，就会产生目的基因的副产品，从而干扰实验结果。鉴于以上这两点，所以应对探针精心设计，并将其末端完全磷酸化。