流式细胞技术基本原理应用和发展趋势

流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。

光源、液流通路、信号检测传输和数据的分析系统是流式细胞仪的主要组成。目前临床中运用流式细胞仪进行外周血白细胞、骨髓细胞以及肿瘤细胞等的检测是临床检测的重要组成部分。

中文名：流式细胞技术 外文名：flow cytometry,FCM 

工作原理：细胞分子水平上通过单克隆抗体 组成:光源、液流通路、信号检测传输

基本概念

流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。

基本结构

流式细胞仪由三部分构成

1.液流系统，包括流动室和液流驱动系统；

2.光学系统，包括激发光源和光束收集系统；

3.电子系统，包括光电转换器和数据处理系统。流式细胞仪的工作原理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图和加三维结构图像进行分析。

用于FCM的样本是单细胞悬液，可以是血液、悬浮细胞培养液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及石蜡包埋组织的单细胞悬液等。

基本原则

1.使各种液体和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本制备和检测；2.针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或EDTA处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态；3.对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法，机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液；4.对石蜡包埋组织应先切成若干40-50um厚的蜡片，经二甲苯脱蜡到水后，再用前述方法制备单细胞悬液；5.单细胞悬液的细胞数不应少于10000个。

流式细胞技术的应用：

1.其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；

2.能准确地进行DNA倍体分析；

3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；

4.快速进行细胞分选和细胞收集；

5.医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究；

6 应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。

用于临床

流式细胞分析仪临床用于细胞治疗中心在FACSVantage革命化的细胞分选功能基础上推出的分选增强（Sort Enhanced edition，SE），BD FACSVantage SE，其新功能和新配置通过与标准多激光多荧光系统以及数据处理系统的完美整合，速度更快，功能更强，是当今流式技术的最卓越体现。

发展趋势

当前，临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点，其发展趋势主要体现在以下几个方面。

一．从相对细胞计数到绝对细胞计数

流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群体中亚群细胞的计数，如淋巴细胞可依其表面标志的不同分为T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）、NK细胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴细胞又可进一步分为辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD4-CD8+）等。这些亚群细胞计数过去多以相对百分比表达结果，由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例，并不能体现其在单位体积血液中的绝对数量，而对艾滋病等一些疾病的临床诊断，有时需要考虑细胞的绝对数量，如患者血液中T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+CD8-）的数量<200个/μL，而未发病（仅有HIV感染）者的数量>200个/μL。T淋巴细胞亚群的绝对计数在国外实验室早已成为常规检查，但在国内仅有少数实验室开展。可以预见，随着干细胞技术的发展，对造血干细胞等的绝对数量分析，不久的将来，也将作为常规检查项目，走出实验室进入临床。

流式细胞绝对计数在临床可开展的项目包括：①淋巴细胞亚群，尤其是T淋巴细胞亚群的绝对计数。②外周血或骨髓中造血干/祖细胞的绝对计数。③血液中网织红细胞的绝对计数。④血液中血小板数量，尤其是血小板减少症患者血小板的绝对计数，此种计数优于血细胞分析仪法，已成为血小板计数的国际推荐参考方法。此外，可能出现在血液中的其它一些稀少细胞（如内皮细胞、转移的肿瘤细胞等）的计数，也将发展为流式细胞绝对计数。流式细胞绝对计数的开展对临床疾病的诊断、治疗等有重要意义。

二．从相对定量到绝对定量分析

细胞的多种成分如某些抗原或受体表达的流式细胞分析，以前多以平均荧光强度（MFI）或相对荧光强度（RFI）表达其含量。由于流式细胞仪每次的仪器状况可出现差异，每个实验室所用仪器的类型也不尽相同，因此，以MFI或RFI表示细胞抗原或受体的表达量缺乏可比性，虽然流式细胞仪有极高的荧光灵敏度，但却无法准确应用这些信息。近年来，为了通过FCM精确定量分析细胞的某些成分，定量流式细胞术（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐渐得到发展，其定量分析原理主要有两种：①定量抗体微球法：在特制的微球上包被已知分子数的羊抗鼠IgG分子，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子数的混合微球，此微球与待测标本在相同条件下与荧光素标记的单克隆抗体（McAb）反应后在流式细胞仪上测定其荧光强度，根据微球上所包被的羊抗鼠IgG分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程，再将待测样本中阳性细胞的对数荧光强度代入方程即可求得其每个细胞上的平均抗原分子数（抗原结合位点数）。②定量荧光素分子微球法：在特制的微球上直接包被荧光素分子，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同数量荧光素分子的混合微球。在流式细胞仪仪器设置相同的条件下测定此微球及待测细胞的荧光强度，根据微球上所包被的荧光素分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程，再将待测样本阳性细胞的对数荧光强度代入方程，可求得每个细胞上的平均荧光素分子数，根据用于样本测定的单克隆抗体（McAb）与荧光素结合的分子比例，计算每个细胞上的平均抗原分子数。单细胞的抗原或受体定量是流式细胞分析的重要进展，为细胞的生物学、分子生物学、生物化学及免疫学等研究提供了更精确的方法。例如，白血病原始细胞膜的CD45分子表达量低于正常淋巴细胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子数显著高于静止血小板，活化淋巴细胞的CD69分子数显著增高，活化中性粒细胞膜CD64分子数显著高于静止中性粒细胞，强直性脊柱炎患者T淋巴细胞膜HLA-B27分子数明显增高。CD8+T淋巴细胞膜的CD38分子数增高是慢性HIV感染者病情发展或死亡的更有力的预后指标；AIDS治疗有效后，CD8+T淋巴细胞CD38分子数显著降低。

三．从单色到多色荧光分析

流式细胞分析已从最初的间接免疫荧光染色、单色或双色直接荧光染色，迅速发展到三色、四色甚至五色或六色荧光分析，使得对细胞亚群的识别和分选、细胞功能评价等更为精确。目前，淋巴细胞亚群的分析、白血病免疫表型分析，均应使用至少三色以上的荧光分析才更可靠。例如：辅助/诱导T淋巴细胞四色荧光分析的免疫表型为CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴细胞白血病的异常淋巴细胞的四色免疫表型为CD5+CD10—CD19+CD45+。多色荧光分析是流式细胞技术发展的必然趋势，有条件时应尽可能地采用。

四．从细胞膜成份到细胞内成份分析

细胞膜免疫表型分析是最重要的流式分析内容之一，很多细胞亚群的检测和分选均是以细胞膜的免疫表型特征为依据，如T、B淋巴细胞和NK细胞分析、白血病免疫分型等。然而，仅有膜免疫表型的分析是不够的，尤其对一些细胞的系列鉴定和功能状态分析常常较为困难，而细胞浆或细胞核内成份的分析则更能反映某些细胞的系列特征和功能变化。随着近年来细胞内成分检测技术的不断完善，细胞内成分检测已成为流式细胞分析的又一个热点。例如，急性髓系白血病性原始细胞浆中检测到髓过氧化物酶（MPO）是最为准确的系列标志，急性B淋巴细胞白血病性原始细胞胞浆中检测到CD79a是最为特异的系列标志；检测T淋巴细胞胞浆内细胞因子合成的种类及含量和膜CD69分子表达，是判断T淋巴细胞活化及其功能的重要手段，而且还能将辅助/诱导T淋巴细胞（Th）进一步分成Th1和Th2亚类，在Th1和Th2细胞浆中可分别合成γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通过细胞内成分检测技术与多色免疫荧光分析方法相结合，可检测不同细胞亚群合成的不同细胞因子（Cytokine），如用五色疫荧光分析血液中淋巴细胞经诱导剂刺激后，辅助/诱导T淋巴细胞亚类—Th1细胞内有细胞因子合成的免疫表型为CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。

五．液体中可溶性成分的流式细胞分析

从传统意义上讲，流式细胞技术只能分析细胞及其成分，液体中的可溶性成分则不能进行分析。然而，如果将液体中的可溶性成分结合在一种类似于细胞大小的颗粒（如乳胶颗粒）上，流式细胞仪便可以对其进行分析，这就是近年来发展起来的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技术。CBA的原理是将包被某种抗原或抗体不同大小的微球与待测液体中的相应成分反应形成抗原与抗体的复合物，再加入荧光素标记的第二抗体，微球上结合的待测抗原或抗体分子数量与其荧光强度呈线性关系，由此可对待测液体中与微球上包被抗原或抗体分子相对应的成分进行定性或定量分析，例如同时测定血清或细胞培养液中的多种细胞因子，同时测定血清中多种自身抗体。CBA发展的时间虽很短，目前所能检测的项目还不多，但其发展潜力不容忽视。已知检测细胞因子的方法有多种，包括靶细胞功能分析法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶免疫分析（Elispots）等，但CBA与之相比，其灵敏度极高、可达2pg/ml，而且能同时测定单个标本中的多种细胞因子。

六．分子表型分析

分子表型分析（Molecular Phenotyping）是指用流式细胞技术检测细胞中特异性核酸序列或特异性基因异常。流式分子表型分析与免疫表型分析技术相结合，为所选择细胞亚群的特异性核酸序列（如癌基因、病毒核酸等）检测提供了一种非常有用的工具，具有广阔的应用前景。流式分子表型与免疫表型分析结合的基本技术路线是：①待测细胞首先与特异性细胞亚群的单克隆抗体反应，②固定并渗透细胞，③通过PCR进行引物特异的核酸序列扩增，④应用对扩增产物的特异性寡核苷酸荧光素标记探针进行荧光原位杂交（FISH），⑤加入针对细胞亚群单抗的荧光素标记的第二抗体。⑥流式细胞仪检测及数据分析。例如，流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液CD4+细胞中HIV特异的DNA或RNA，对于AIDS的病程监测、治疗反应以及预后等具有重要价值。

流式荧光原位杂交（Flow-FISH）法可测定染色体端粒长度。细胞的染色体端粒是由2~20Kb串联的短片段重复序列(TTAGGG)n和一些结合蛋白组成，端粒长度越长，所含重复碱基数目越多；用荧光素标记的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特异性探针进行FISH后，端粒的长短可以流式细胞仪检测到的荧光强度的高低反映出来；Flow-FISH测定精度可小于3Kb的端粒长度差，对肿瘤的发生与发展、治疗与预后等的研究有一定价值。

流式细胞术攻略：原理、实验方法和问题解决

文献中我们经常能看见这种图，也就是流式结果分析图，美观、简单、一目了然。

流式细胞术（flow cytometry）是20世纪60年代后期开始发展起来的利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术，主要分为流式分析和分选2部分。

今天我们主要介绍流式分析中基本操作与技巧，首先简要了解一下什么是流式细胞术。

一、流式细胞术的3大要素

1. 流式细胞仪：现在市面上有多种型号的流式细胞仪，但其基本结构都是相同的，分析性流式细胞仪有液流系统、光路系统、监测分析系统。

（1）液流系统

（2）光路系统

光路系统始于激光器，其分类分法很多，最常用的分类方法是根据其发射的激光的波长来分，如常见的有488nm的蓝激光器、635nm的红激光器和405nm的紫激光器，不同的激光器发出的激光照射到细胞后产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。

流式细胞仪采集的光信号包括散射光信号和荧光信号，散射光信号也就是我们常说的FSC（前向散射光，反应细胞的大小）、SSC（侧向散射光，反应细胞的复杂程度）；荧光信号是细胞上结合有荧光素，被激光激发以后，会发射荧光信号。

（3）检测分析系统：

流式细胞仪的检测分析系统就是以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析，最后得出样品群体中细胞的物理化学特征。

通道，我们可以理解为就是光电倍增管，有2个作用，①将光信号转变为电子信号；②放大电子信号。可以分为散射光通道（FSC通道、SSC通道）和荧光通道，一个激光器下可以有多个荧光通道，一个通道对应多个荧光染料，例如以beckman的DXflex机器的638nm红激光器为例，APC通道可以接收 APC、Alexa Fluor647、eFluor660荧光信号，原则上，这3种荧光素不能同时标记一个样品，否则，就无法分析该通道上的信号是来自于哪种荧光素。

另一个重要组成部分就是计算机分析系统，例如BD的DIVA系统。

二、样品细胞：流式细胞术检测的对象一般是细胞，并且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，如果要检测组织中的细胞，必须先将组织制备成单细胞悬液。

三、荧光偶联抗体：样品细胞只有标记荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号，从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱等情况。

二、流式细胞术的基本操作与技巧

以体外培养的PBMC细胞为例：

1、细胞培养在96孔板中，直接收集细胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C离心5min，弃上清；

2、然后用1ml FACS buffer重悬沉淀，350g，4°C离心5min，弃上清；

3、封闭：标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体，其基本结构都由两部分组成，即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段，抗体的特异性表现在Fab段，标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合，从而标记并且相对量化细胞表达该抗原分子的情况。但是，有些细胞表面表达FcR(Fc receptor, Fc受体），如巨噬细胞、DC、B淋巴细胞等， FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc段进行非特异性的结合，对结果产生一定的影响。

封闭方法1：取适量的血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀，4'C静置 15min。研究人的细胞时，若荧光素偶联抗体来源于小鼠，封闭采用小鼠血清全IgG抗体。 原则是，如果流式抗体可能与样品细胞的FcR发生非特异性结合，那么在标记荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体进行封闭，使样品细胞表面的FcR饱和。

封闭方法2：适量的抗CD16和抗CD32单克隆抗体与样品细胞充分混匀，4'C静置 15min。CD16是一种FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力较强； CD32也是一种 FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力中等。 而荧光素偶联抗体基本上是IgG抗体，所以在标记荧光素偶联抗体前可以用抗CD16和抗CD32单克隆抗体封闭样品细胞，使样品细胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32单克隆抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。

4、标记相应的荧光素偶联抗体，这里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例，一般染色体系推荐100μl，CD3、CD4表达量相对较高，1μl足够了，假如有9个样本，分别取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混匀后，分别取100μl加到9个样品孔中，混匀，室温、避光染色20min；

5、加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体，350g，4°C离心5min，弃上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉淀，尽快上机分析。

6、电压的设定：上机分析时，确认机器没有问题后，首先就是调节每个通道的光电倍增管的电压，目的是为了区分细胞群，假如我们想研究人的淋巴细胞群，我们都知道人的PBMC含有淋巴细胞、单核细胞还有中性粒细胞等，那我们怎么把它们分开呢？这时候就要用到我们前面提过的FSC和SSC，通过调节FSC和SSC的电压，区分淋巴细胞亚群，原则就是使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的电压确定之后就开始调节APC-cy7、FITC的电压（我们可以在铺细胞的时候多铺一个孔，染色时将CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC电压的调节），原则就是使阳性细胞群和阴性细胞群尽可能的分离。

7、对照的设置：

流式实验中对照设置很重要，常见的有阴性对照、FMO对照、补偿单阳管对照。

（1）阴性对照：每一种细胞都会产生非特异性荧光，流式检测时得到的荧光信号是细胞本身的非特异性荧光和来自于细胞表面结合的荧光素的特异性荧光叠加得到的结果。所以，确定与荧光素无关的细胞自身的非特异性荧光的强弱非常重要，此时就需要设立阴性对照。下图3类阴性对照是比较全面的阴性对照，但我们实验中设置阴性对照不需要3种阴性对照全部设置齐全，一般只需要设置1种阴性对照就可以了，推荐第1类或第3类。

① 第1类'negative'表示 的是不加任何荧光素偶联抗体时得到的荧光信号，即“blank”因为没有标记任何荧光素，所以这组得到的荧光信号与荧光素无关，与细胞抗原分子是否表达无关，得到的荧光信号代表的是非特异性荧光信号（当实验要求不高、已进行预实验或者能够确定同型对照的荧光信号与不加同型对照的这种阴性对照结果一致时，就可以采用这种阴性对照的设置）；

② 第2类“抗CD69'表示的是用抗CD69抗体标记样品细胞后得到的荧光信号，虽然抗CD69抗体能够与细胞表面的CD69抗原分子结合，但是抗CD69抗体没有偶联荧光素，所以得到的荧光信号也与细胞表面是否表达有CD69分子无关，得到的荧光信号代表的也只是细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除抗体的影响（第2种阴性对照设置方法只是一种理论上的设置方法，是为了便于理解阴性对照的设置原理，一般流式分析时不会应用到这种阴性对照）；

③ 第3类'IgG1-PE'表示的是标记与抗CD69抗体同种属（来源于同一物种）且同类（抗CD69-PE中的抗体是IgGl类的）的非特异性抗体(IgGl)与PE荧光素偶联的同型(isotype)对照抗体(IgGl-PE)后，得到的荧光信号，这种同型对照抗体不能与细胞表面的CD69 发生特异性结合，所以细胞表面不会结合有IgGl-PE, 最后得到的荧光信号不是PE荧光素产生的特异性荧光信号，而是代表细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除荧光素的影响（第3种阴性对照的设置方法，称为同型对照设置，是常规的阴性对照设置法，正式的流式图的数据都必须建立在这种同型对照的基础之上，在同型对照基础上得出的流式结果是最可靠的，尤其是对于一些阴阳分群不明显的情况下，可将同型对照作为划门的依据）。

（2）FMO（fuorescence-minus-one control）对照：即减去一个荧光抗体（一般是表达量低、背景荧光干扰强），其它组合不变，是一种特殊的阴性对照，多在研究不同细胞亚群表达某些重要的表型分子、细胞因子等时应用。如Foxp3 FMO，也就是不加Foxp3-PE，只加入CD4、CD25，与三个染料都加组相比，多出来的那部分就是Treg细胞群。

（3）补偿单阳管对照：以上面我们提到的CD3-APC、CD4-FITC为例，在这里，我们要设置PE单染管和FITC单染管，用于补偿的调节，一般单染管要求有明显的阳性细胞群，像CD3、CD4表达量都很高，阳性细胞群明显，但对一些抗原表达弱的情况（阳性细胞群基本看不到），例如CD25，这时候有必要借助补偿微球。

总结

常见对照的作用

三、注意事项

（1）在细胞制备、培养阶段，如果该培养细胞是贴壁细胞，需用先用胰酶消化细胞，然后收集待测样品细胞，离心、洗涤、封闭后标记荧光素偶联抗体即可。

（2）如果是胸腺、脾脏和淋巴结等外周免疫器官，主要由免疫细胞组成，制成单细胞悬液，只需直接将脏器经钢网研磨即可。

（3）如果是实体脏器肺脏、肝脏和肿瘤组织内含有较多的结缔组织，实体脏器细胞之间一般结合紧密，所以直接研磨脏器法无法得到理想的单细胞悬液。因此，研磨前需将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶消化，消化后的组织再用研磨棒直接研磨。实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，如果研究目标不是实体细胞，而是脏器内浸润的免疫细胞，可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞，然后再进行流式分析。

（4）调节电压时，如果检测的目标细胞体积较小，可以适当提高电压值，使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离；如果检测的目标细胞体积较大，可以适当降低电压值，使所有的目标细胞群完整显示于流式图中，防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外。

（5）关于样本的封闭，并不是标记荧光素偶联抗体之前必须封闭样品，一般样品细胞与流式抗体的种属来源是不同的，如标记人的细胞的荧光素偶联抗体一般来源于小鼠，人细胞的FcR也不一定能够与小鼠来源的荧光素偶联抗体的Fc段结合，但是，也有可能因为种属关系较近，或者在一定环境条件下这种不同种属间的Fc段和FcR也能结合，实验者很难判断实验过程中这种结合是否会发生，但是在标记荧光素偶联抗体前封闭样品却可以保证这种非特异性结合一定不会发生。所以，条件允许的话，实验者最好养成封闭样品的习惯。