关于外泌体的肿瘤应用研究进展

　　外泌体是由多种活细胞通过内吞-融合-外排等一系列生物学机制而形成的，具有脂质双层膜结构的纳米级微小囊泡。其最早是在1983年由Johnstone RM等研究羊成熟网织红细胞过程中囊泡的形成时发现，在生理和病理条件下，都可以被一些细胞以胞吐的方式所释放，如：免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞，且广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、乳汁、脑脊液等多种体液中。外泌体含有大量生物活性物质，如蛋白质、核酸、脂质、病毒和朊病毒等。这些成分在肿瘤微环境内相互作用，在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。

　　生物学特性

　　外泌体的密度为1.13～1.21g/mL，直径约为30～100nm，在电镜下观察常呈杯型或双凹碟型，在人体体液中常呈球型。通常采用超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、色谱法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法等方法提取得到外泌体。外泌体含有大量生物活性物质，如蛋白质、核酸、脂质、病毒和朊病毒等。外泌体中脂质成分主要包括胆固醇、鞘磷脂、卵磷脂、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经节苷脂、聚甘油磷脂、饱和脂肪酸等，这些脂质结构具有提高细胞膜稳定性的作用。

　　外泌体中含有丰富的蛋白质，主要包括膜运输和融合相关的蛋白质如Rab蛋白、GTP酶、膜联蛋白等；细胞骨架成分如肌动蛋白、微管蛋白等；四跨膜蛋白，如CD9、CD63、CD81、CD82等；与外泌体形成相关的蛋白质如肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）、ALG-2相互作用蛋白X（ALix）、内体分拣转运复合物（ESCRT）等；热休克蛋白如HSP70、HSP60和HSP90。此外，外泌体还包含与细胞来源和组织类型相关的各种特异性蛋白，如主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCI）、MHCⅡ、细胞黏附分子等。除蛋白质和脂质外，外泌体还包含大量的核酸，如信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（LncRNA）和DNA等。

　　外泌体与肿瘤免疫治疗

　　近日，来自加州大学旧金山分校（University of California, San Francisco）的研究人员在Cell杂志上发表文章，发现肿瘤来源的外泌体上的PD-L1也参与了肿瘤细胞的免疫治疗逃避。重要的是，对于一些PD-L1抗体治疗效果不佳的肿瘤类型，通过抑制外泌体PD-L1分泌并同时进行PD-L1抗体治疗，能够实现良好的抗肿瘤免疫治疗。

　　外泌体生物发生的关键酶包括NSMASE2（又称SMPD3）和RAB27A，SMPD3促进囊泡内体的萌芽，RAB27A参与MVB与质膜的融合。因此，通过对这些酶调控可实现对外泌体在体内作用的干预。通过对Rab27a和nSMase2进行基因敲除以及从外源引入的外泌体方式，研究人员发现来自肿瘤细胞的外泌体PD-L1以免疫依赖的方式促进肿瘤生长。

　　实验表明，外泌体PD-L1在引流淋巴结处抑制T细胞功能。外泌体PD-L1能够促进PD-L1抗体治疗的耐受性，在PD-L1抗体治疗无效的前列腺癌中，PD-L1和外泌体促进前列腺癌细胞生长。值得注意的是，短期存在的外泌体PD-L1缺陷也会导致长期全身性的抗肿瘤免疫。外泌体PD-L1的这种作用在结直肠癌模型中也被证实。在结直肠癌中，PD-L1抗体与外泌体PD-L1分泌的抑制可共同实现肿瘤抑制效果。因此，外泌体PD-L1是一种新的免疫治疗靶点，可以解决目前PD-L1抗体治疗存在的耐受性问题。

　　外泌体与乳腺癌

　　Sirtuins是NAD+依赖性去乙酰化酶,其成员SIRT1失调的遗传和代谢背景可能描述其肿瘤抑制功能。SIRT1的丢失与细胞周期缺陷、染色体不稳定性以及包括乳腺癌在内的几种癌症类型中的DNA修复受损有关。

　　来自康奈尔大学的研究人员在近期的Developmental Cell杂志上发表文章，鉴定了SIRT1的新型乳腺癌肿瘤抑制功能。研究人员报道SIRT1的损失损害溶酶体功能，导致促肿瘤发生外泌体和水解酶组织蛋白酶B的分泌增加。这些促肿瘤发生的外泌体可以重塑细胞外基质并增强培养的乳腺癌细胞的侵袭性。

　　该研究表明浸润性乳腺癌细胞中SIRT1的缺失限制了溶酶体酸化并使MVB重新导向与细胞表面融合，从而增加了外泌体和水解酶的分泌。这些分泌的因子一起增加了侵袭性较小的癌细胞的侵袭和增殖。虽然SIRT1缺失细胞的分泌蛋白组的体内相关性未知，但证据表明SIRT1的丧失足以改变细胞间通讯和受体癌细胞的行为。该研究为癌症中的溶酶体生物学提供了新的见解，并开启了关于外泌体成分包装调控和外泌体对肿瘤微环境中受体细胞的影响的新见解。

　　外泌体在肺癌诊断中的作用

　　随着对肺癌诊断方法研究的深入，目前国内外正在广泛研究血清生物学标志物联合低剂量螺旋CT（LDCT）的肺癌诊断策略，通过血清生物学标志物筛查肺癌是目前研究的热点和趋势。研究表明，外泌体分泌的miRNA和蛋白质可作为肺癌临床应用中较理想的新的生物学诊断标志物。

　　Giallobardo M等利用定量聚合酶链反应（qPCR）分析NSCLC患者血液中提取的外泌体所分泌的8个miRNA（miR-30B、-30C、103、-122、-195、-203、-221和-222）均与NSCLC相关；Cazzoli R等采用qPCR研究发现肺腺癌患者血液提取的外泌体所携带的4种miRNA（hsa-miR-378A、-379、-139-5P和-200B-5P）较健康吸烟者表达水平高，6种miRNA（hsa-miR-151A-5P、-30A-3P、-200B-5P、-629、-100和-154-3P）在肺腺癌中表达水平明显高于肺肉芽肿患者；Rodriguez M等研究发现肺癌患者血液中外泌体含有的miR-122-5P表达量高于支气管肺泡灌洗液（BALF）所分离的量。

　　Vanni I等研究发现肺癌患者血液外泌体来源的miR-25和miR-223的表达水平较正常人升高，而let-7F、miR-20B和miR-30E-3P的表达水平前者较后者明显降低，这种差异性表达为肺癌的诊断带来潜在应用价值。此外，外泌体蛋白质也可以作为肺癌标志物。Huang SH等研究发现从NSCLC患者组织提取分离的外泌体蛋白质中约80%含有EGFR，在肺部慢性炎症患者中只有约2%的外泌体蛋白含有EGFR；另一项研究采用EV阵列分析法研究表明外泌体蛋白可作为晚期NSCLC的潜在诊断标志物。通过免疫印迹和免疫组织化学法研究发现肺癌患者尿液来源的外泌体中的人富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG1）是NSCLC非侵入性诊断的候选生物学标志物。

　　Ueda K等通过对1369个外泌体蛋白进行质谱定量分析，发现CD91可作为鉴别肺腺癌特异抗原的外泌体，CD91联合癌胚抗原（CEA）可作为肺癌诊断标志物，两者联合检测的灵敏度和特异度均高于单独检测CEA。以上研究表明，外泌体的相关miRNA和蛋白质检测将为肺癌患者的早期发现、早期诊断提供更可靠的依据。（转化医学网360zhyx.com）

　　参考来源：

　　1.Mauro Poggio et al. Suppression of exosomal PD-L1 induces systemic anti-tumor immunity and memory. Cell 2019, 177, 414–427, April 4.

　　2.Latifkar A, Ling L, Hingorani A, Johansen E, Clement A, Zhang X, Hartman J, Fischbach C, Lin H, Cerione RA, Antonyak MA. Loss of Sirtuin 1 Alters the Secretome of Breast Cancer Cells by Impairing Lysosomal Integrity. Dev Cell. 2019 May6；49(3):393-408.e7. doi: 10.1016/j.devcel.2019.03.011. Epub 2019 Apr 11.

　　3.现代肿瘤医学 2019 年 5月第27卷第9期，肿瘤医学论坛综合整理