骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。
（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节 需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。
2．细胞融合的步骤
（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。
与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周龄
↓
拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）
↓
反复冲洗，吸出冲洗液
↓
冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min
↓
用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml
↓
加入96孔板，100μl/孔
↓
放入37。c CO2孵箱培养
（2）制备免疫脾细胞
最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死
↓
无菌取脾脏，培养液洗 一次
↓
脾脏研碎，过不锈钢筛网
↓
离心，细胞用培养液洗2次
↓
计数
↓
取108脾淋巴细胞悬液备用
（3）制备骨髓瘤细胞
取对数生长骨髓瘤细胞离心
↓
用无血清培养液洗2次
↓
计数，取得×107细胞备用
（4）融合
①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。
③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
④离心，800rpm, 6min。
⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。
⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。
⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测
1．HAT选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。
2．抗体的检测 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。
（四）杂交瘤的克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。
1．有限稀释法克隆
（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。
2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。
（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。
（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。
（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。
（6）8～9天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。
（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。
（8）每个克隆应尽快冻存。
2．软琼脂培养法克隆
（1）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640。
①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
（2）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
（4）1ml 0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。