56) 向您请教一个问题，我用pET28载体、宿主菌BL21(DE3)表达目的蛋白，目的蛋白的两端都带His-tag,蛋白的大小为37kD，在利用Ni-NTA纯化时总是在目的蛋白带旁边伴随一条带去除不了，请问有什么高招可以解决这个问题？!!!此外，该表达产物为包涵体，请问这种产物可不可以直接用来制备抗体？谢谢！！！
也许这两个都是你要的目标蛋白呢,会不会是这样呢,你可以用his的抗体做WB看看是不是这样的,如果是,那说明是这样的情况.此外你可以再平衡缓冲液中加0.5%的吐温等表面活性剂,这样可以去除一些非特异吸附,此外你可以用pH45左右的变性溶液去洗,这样也能去掉一些杂质,最后在用咪唑溶液洗脱.如果你这样都去不掉,而做WB也有两条带,那说明可能是降解,超声破碎的时候功率别太大,时间也别太长,注意温度,因为超声有时候也可能会使蛋白降解.
57) 我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。
你可以在你的平衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MNaCl,这样可以降低一些因为离子作用带来的非特异吸附.同时在平衡液里加0.5%吐温等表面活性剂,这样是不是有点改善,此外你也可以用阶段洗脱的方法,例如用5mM和10mM还原谷胱甘肽去分别去洗脱,这样看看有没有什么区别.此外还要注意的问题是超声破碎时注意功率和时间.避免过强时间过长,降解蛋白.
此外你可以GST抗体做WB看是不两个都是你要的东西，会不会是降解或造成这样的结果。你可以加点酶的抑制剂，此外抱歉我不是主任，嘿嘿。
58) 我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？
30％－60％硫酸铵沉淀可能对你的目的蛋白来讲，太粗略了，如你所言，目的蛋白可能在沉淀中，可否分级沉淀，３０％－５０％，５０％－６０％，再测一下活性可能就分开了，20mg/ml的蛋白浓度对于层析是有点高，洗脱液浓度变化或PH的改变都会使蛋白有损失，最好不要超过１０mg/ml。
59) 我的蛋白是用pGEX-4T载体在BL21中表达的，表达量很高，形成包涵体，为了获得可溶性蛋白，我现在尝试用较低浓度的诱导剂诱导，此前用不同浓度诱导做过对比，电泳后表达量的差异不大；但当我再降低温度诱导后发现，超声处理后的上清液中目的蛋白条带很微弱，大部分目的蛋白还是在沉淀中；这和我降低诱导剂前做的不一样（同温度），为什么目的蛋白的可溶表达会不稳定呢？对同一菌种应该是固定的吧？我很迷惑．
另外，请问，一般情况下２８度，３０度诱导时间应该分别多少才合适？我们的光度计出了点问题，无法测定ＯＤ值．谢谢．
还有，你有没有较好的蛋白纯化的文献介绍几篇，好吗？
60) chromatography 兄，请教一个问题:
选择填料的时候，CM和SP怎么选择？什么时候选择弱阳？什么时候选择强阳？
再问一个：
我们实验室有两种蛋白，一种等电点5左右，另一种等电点9左右，为什么都可以用CM阳离子交换纯化？（用的缓冲液都呈中性）
等电点5的那个我觉得选择阴离子交换柱好些，为什么不这样？
没有什么特别的原则，重要是纯化的效果好就可以，一般都是先选择弱的．
纯化是把目标蛋白和杂质分开就可以，所以其实在这样的情况下，酸性蛋白是挂在阴离子柱上，而后面的挂不住，但是只要能把它们和杂质分开就可以．所以酸性蛋白流穿，杂质被吸附也可以，所以不一定非要吸附也可以．
61) 我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？
也不是，其实沉淀你可以做仔细点，例如先用３０％沉淀，取上清，再把上清加到４０％，然后如此类推，一直到６０％，然后测定沉淀和最后上清的活性，这样就知道哪样的浓度沉淀效果比较好，既然你的活性都在沉淀里，那直接溶解在一定浓度的盐中，直接过滤上柱子就可以，浓度高也没有关系．
62) 急问：我的样品蛋白液本来放在４C保存，谁知有人把温度调到了１８C已有一天，请问这样对蛋白会有多大影响？我纯化的是一种酶。另外，树脂在这样的温度下性质会有所改变吗？某人说４C－３０C的情况下，树脂不会有太大改变。是这样么？谢谢！
不知道你的蛋白稳定不稳定，你可以测定一下活性看看，如果没有什么变化，那就没有关系，树脂不会因为温度有什么变化的，尤其是你的树脂不是以蛋白为配基的亲和填料．，没错在４C－３０C的情况下是没有多少改变，但是那也看多长时间，什么树脂，因为时间长会长菌如果不加抑菌措施的话．
63) 我用鼎国的sepharose 4-B 合成亲和柱可以吗？
是活化好的吗，还是普通的琼脂糖，他们的填料颗粒有的比较粗，不知道你选择的粒径是多少范围的，最好要细一些，４５－１６５um比较好，用一般应该没有问题．
64) 比如说，sephadex G-25的分级范围是1000～5000，我想问一下，分子量小于1000的分子（例如盐）是怎么样通过的？它是从凝胶内部通过吗？不是说只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过吗？
凝胶的中间有的是大小不同的孔,盐自然在这些孔中间通过,而所谓的分离范围也只是说在这样的分子范围内有差别,离开这个范围就没有分离效果,所以小的和大的都没有什么分离效果,因此不是只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过.而是在这个范围的分子有分离效果.
65) 请教：要从发酵液中纯化出一个分子量约为1100的具有抗菌活性7肽，前期的提取采用的是酸沉醇提的方法，粗提物中蛋白含量39mg/ml。资料上说，纯化这个小肽要用sephadexLH-20，可是我没有。：（尝试用sephadax G15 进行了纯化，出现了五个没有分开的峰，第六个峰分的还算可以。考虑到可能是粗提物中的组分太多，于是对粗提物用sephadex G200进行了纯化，得到一个单一峰，收集后，冷冻干燥，再过sephadex G50，得到两个吸收峰，可是实验发现，这两个吸收峰没有抑菌活性了：（洗脱液用的是pH7.0的PBS，检测波长280nm。请问可能出现的问题有哪些？洗脱液选择的有问题？检测波长有问题？｛我的这种多肽，资料上说HPLC的检测波长为210nm,也有205nm的。｝
你的问题很不明确,用sephadexLH-20纯化除了有一部分凝胶过滤外,还有一些分配色谱的作用,所以这个介质和sephadax G15 是不太一样的,你纯化出多少峰都应该进行抑菌实验,否则很难知道你要的组分在哪里.既然这个分子量这么小,那你上sephadex G200,估计你的目标多肽在最后面,所以你得到的那个峰不一定有你要的东西,而在后面,我是这样猜测的,关键你要测定活性,所以你再纯化也没有活性,问题在于你没有时时做活性检测,填料选择不很正确,检测波长我不清楚对不对,关键你要选择合适的柱子,同时每一步都做活性检测.