MHC四聚体技术：检测抗原特异性T细胞的金标准

细胞在肿瘤、病毒、细菌、寄生虫、移植组织、过敏原、甚至自身抗原的适应性免疫应答中都发挥着重要的调节作用。大部分 T 淋巴细胞在其细胞表面表达单一的、高度特异性的抗原受体（TCR），与 MHC-抗原肽复合物相结合并识别其中特异的抗原肽，启动获得性/特异性免疫应答机制，比如 T 细胞介导的细胞免疫和 B 细胞介导的体液免疫。

由于 TCR 与 MHC-抗原肽复合物之间的亲和力低，半衰期短，相互结合后容易快速脱落，重组的可溶性 MHC-抗原肽复合物单体并不适合用于抗原特异性的 T 细胞检测。

1996 年，美国斯坦福大学 John D. Altman 博士等人开发出 MHC-抗原肽复合物四聚体（简称：MHC 四聚体）技术。该技术由 4 个 MHC-抗原肽单体分子及荧光染料组成的复合物，它以带有信号标记的链霉亲合素为基础，交联四个 MHC 分子单体，形成 MHC 四聚体；

一个 MHC 四聚体分子可与同一 T 细胞表面的 3-4 个 TCR 相识别并结合，从而大大增强了 MHC-抗原肽复合物与 TCR 之间的结合力和检测特异性，并可通过流式细胞术成功实现对抗原特异性的 T 细胞的离体分析。

如今，MHC 四聚体技术已成为 T 细胞免疫应答定量的「金标准」。它极高的灵敏度和抗原特异性，适用于一些相关的基础研究和临床应用，包括：特异性 T 细胞高效分选；抗原表位短肽亲和力筛选；病毒逃避免疫机制研究；T 细胞表面受体 TCR 亲和力研究；可作为分子标记，应用于「T-Cell Receptor-Like Antibodies」筛选研究；MHC 免疫功能研究等。

MHC 四聚体已广泛应用于疫苗研发；细胞治疗研究等。并具备诊断试剂开发潜能。

四聚体技术优势

与其他应用于 T 细胞检测的传统方法相比，如酶联免疫斑点检测（ELISPOT）、单细胞 PCR 等，MHC 四聚体分析技术具有以下优势：

高灵敏度：可检测血液中低丰度（≤1%）的抗原特异性 T 细胞

高特异性：极大提高了 TCR 与 MHC-抗原多肽复合物结合的特异性

稳定性好：检测结果一致性好，可重复性高

多样化/个性化：可定制，合成特异的抗原多肽片段，组合成各种 T 细胞选择性 MHC 四聚体

定性/定量分析：可结合流式细胞术实现对抗原特异性 T 细胞群的定性/定量分析

荧光标记选择灵活： 可选用 PE 或者 APC 标记

HelixGen MHC 四聚体试剂染色步骤

广州好芝生物（www.helixgen.com.cn）推出的 HelixGen TM MHC 四聚体产品，能快速、简便地实现对抗原特异性 T 细胞（Antigen-specific T cells）的定性与定量分析。

（一）所需主要试剂和设备

1）欲检测的细胞或全血；

2）荧光染料标记 Anti-CD8 抗体或其它抗体；

3）离心机、流式细胞分选仪等。

（二）基本操作流程

细胞准备

1.外周血单核细胞、脾细胞、淋巴细胞、常规细胞系细胞等，以 2-5×107/ml 的密度重悬于 FACS Buffer（PBS+ 2% 小牛血清+0.1% 叠氮钠；建议使用时新鲜配制），制备成细胞悬浮液。

2.取 25ul 细胞悬浮液滴加入微孔培养板或 FACS 试管。

Staining Cocktail 制备

3.制备 2X Staining Cocktail：FACS Buffer+ MHC 四聚体（建议稀释比例为 1:50～1:100）+ Anti-CD8/FITC 抗体或其他用作内参的抗体（请参考其说明书进行稀释）。

染色孵育

4.取 25ul 2X Staining Cocktail，滴加入步骤 2 中的微孔培养板或 FACS 试管，与细胞悬浮液混匀。（注意：使用移液器轻柔上下吹打混匀，尽可能避免产生气泡。）5.在冰上或其他已通过实验优化确认的最佳温度条件下，避光孵育 60 分钟。

洗涤

6、加入 150ul FACS Buffer 至微孔培养板每孔或 2-3 ml FACS Buffer 至 FACS 试管，轻柔混匀，避免形成气泡，1200 rpm 离心 5 min，小心除去上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。（注意：对于具有传染性或危害性的样本，可考虑使用吸引器，轻柔吸掉上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。）

7、重复步骤 6，再洗涤 2 次。

细胞固定&流式分析

8、将细胞重悬于 200ul 固定液（PBS+1% 多聚甲醛（PFA））中，使用流式细胞仪进行样本分析。

HelixGen MHC 四聚体试剂染色注意事项

1.染色体系的体积应尽可能小，以节约试剂。例如：25ul 2X Staining Cocktail + 25ul 细胞悬浮液=50ul。

2.所有操作应尽量在 4℃ 条件下进行。一些 MHC 四聚体在室温或更高温度条件下，能获得更高强度的亲和力，可提高染色效果。但另一些细胞表面标志物，比如 CD62L，对较高的温度条件往往比较敏感。

部分 MHC 四聚体已被证实，在 37℃ 条件下容易与细胞解离。故我们建议：在 4℃ 条件下孵育 45-60 分钟，或在室温条件下孵育 30 分钟。

3.在进行大规模试验前，建议先进行预试验，以确定最佳的 MHC 四聚体稀释比例。通常，建议 MHC 四聚体的初始稀释比例为 1:100～1:200。请根据具体实验，优化其稀释比例，以期获得最佳的染色效果。

4.对于新鲜的外周血单核细胞、淋巴细胞、脾细胞，通常建议每个染色样品细胞总数为 1-2 ×106；而对于细胞克隆或者 CTL 细胞系，每个样品细胞总数可减低为 2×105。当针对细胞克隆染色时，建议选取具有不同特异性的其它克隆细胞作为阴性对照。

HelixGen MHC 四聚体定制服务流程

细胞在肿瘤、病毒、细菌、寄生虫、移植组织、过敏原、甚至自身抗原的适应性免疫应答中都发挥着重要的调节作用。大部分 T 淋巴细胞在其细胞表面表达单一的、高度特异性的抗原受体（TCR），与 MHC-抗原肽复合物相结合并识别其中特异的抗原肽，启动获得性/特异性免疫应答机制，比如 T 细胞介导的细胞免疫和 B 细胞介导的体液免疫。

由于 TCR 与 MHC-抗原肽复合物之间的亲和力低，半衰期短，相互结合后容易快速脱落，重组的可溶性 MHC-抗原肽复合物单体并不适合用于抗原特异性的 T 细胞检测。

1996 年，美国斯坦福大学 John D. Altman 博士等人开发出 MHC-抗原肽复合物四聚体（简称：MHC 四聚体）技术。

该技术由 4 个 MHC-抗原肽单体分子及荧光染料组成的复合物，它以带有信号标记的链霉亲合素为基础，交联四个 MHC 分子单体，形成 MHC 四聚体；一个 MHC 四聚体分子可与同一 T 细胞表面的 3-4 个 TCR 相识别并结合，从而大大增强了 MHC-抗原肽复合物与 TCR 之间的结合力和检测特异性，并可通过流式细胞术成功实现对抗原特异性的 T 细胞的离体分析。

如今，MHC 四聚体技术已成为 T 细胞免疫应答定量的「金标准」。

它极高的灵敏度和抗原特异性，适用于一些相关的基础研究和临床应用，包括：特异性 T 细胞高效分选；抗原表位短肽亲和力筛选；病毒逃避免疫机制研究；T 细胞表面受体 TCR 亲和力研究；可作为分子标记，应用于「T-Cell Receptor-Like Antibodies」筛选研究；MHC 免疫功能研究等。

MHC 四聚体已广泛应用于疫苗研发；细胞治疗研究等。并具备诊断试剂开发潜能。

四聚体技术优势

与其他应用于 T 细胞检测的传统方法相比，如酶联免疫斑点检测（ELISPOT）、单细胞 PCR 等，MHC 四聚体分析技术具有以下优势：

高灵敏度：可检测血液中低丰度（≤1%）的抗原特异性 T 细胞

高特异性：极大提高了 TCR 与 MHC-抗原多肽复合物结合的特异性

稳定性好：检测结果一致性好，可重复性高

多样化/个性化：可定制，合成特异的抗原多肽片段，组合成各种 T 细胞选择性 MHC 四聚体

定性/定量分析：可结合流式细胞术实现对抗原特异性 T 细胞群的定性/定量分析

荧光标记选择灵活： 可选用 PE 或者 APC 标记

HelixGen MHC 四聚体试剂染色步骤

广州好芝生物（www.helixgen.com.cn）推出的 HelixGen TM MHC 四聚体产品，能快速、简便地实现对抗原特异性 T 细胞（Antigen-specific T cells）的定性与定量分析。

（一）所需主要试剂和设备

1）欲检测的细胞或全血；

2）荧光染料标记 Anti-CD8 抗体或其它抗体；

3）离心机、流式细胞分选仪等。

（二）基本操作流程

细胞准备

1.外周血单核细胞、脾细胞、淋巴细胞、常规细胞系细胞等，以 2-5×107/ml 的密度重悬于 FACS Buffer（PBS+ 2% 小牛血清+0.1% 叠氮钠；建议使用时新鲜配制），制备成细胞悬浮液。

2.取 25ul 细胞悬浮液滴加入微孔培养板或 FACS 试管。

Staining Cocktail 制备

3.制备 2X Staining Cocktail：FACS Buffer+ MHC 四聚体（建议稀释比例为 1:50～1:100）+ Anti-CD8/FITC 抗体或其他用作内参的抗体（请参考其说明书进行稀释）。

染色孵育

4.取 25ul 2X Staining Cocktail，滴加入步骤 2 中的微孔培养板或 FACS 试管，与细胞悬浮液混匀。（注意：使用移液器轻柔上下吹打混匀，尽可能避免产生气泡。）5.在冰上或其他已通过实验优化确认的最佳温度条件下，避光孵育 60 分钟。

洗涤

6、加入 150ul FACS Buffer 至微孔培养板每孔或 2-3 ml FACS Buffer 至 FACS 试管，轻柔混匀，避免形成气泡，1200 rpm 离心 5 min，小心除去上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。（注意：对于具有传染性或危害性的样本，可考虑使用吸引器，轻柔吸掉上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。）7、重复步骤 6，再洗涤 2 次。

细胞固定&流式分析

8、将细胞重悬于 200ul 固定液（PBS+1% 多聚甲醛（PFA））中，使用流式细胞仪进行样本分析。

HelixGen MHC 四聚体试剂染色注意事项

1.染色体系的体积应尽可能小，以节约试剂。例如：25ul 2X Staining Cocktail + 25ul 细胞悬浮液=50ul。

2.所有操作应尽量在 4℃ 条件下进行。一些 MHC 四聚体在室温或更高温度条件下，能获得更高强度的亲和力，可提高染色效果。但另一些细胞表面标志物，比如 CD62L，对较高的温度条件往往比较敏感。部分 MHC 四聚体已被证实，在 37℃ 条件下容易与细胞解离。故我们建议：在 4℃ 条件下孵育 45-60 分钟，或在室温条件下孵育 30 分钟。

3.在进行大规模试验前，建议先进行预试验，以确定最佳的 MHC 四聚体稀释比例。通常，建议 MHC 四聚体的初始稀释比例为 1:100～1:200。请根据具体实验，优化其稀释比例，以期获得最佳的染色效果。

4.对于新鲜的外周血单核细胞、淋巴细胞、脾细胞，通常建议每个染色样品细胞总数为 1-2 ×106；而对于细胞克隆或者 CTL 细胞系，每个样品细胞总数可减低为 2×105。当针对细胞克隆染色时，建议选取具有不同特异性的其它克隆细胞作为阴性对照。