利用BIAcore分析相互作用的蛋白质

Biacore是基于表面等离子体共振（SPR）技术来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用，无需任何标记物。表面等离子体共振（surface plasmonresonance，SPR）是一种光学现象，在传感芯片发生全反射界面上有一层约50nm厚的金属膜，偏振光入射到棱镜的一端，在棱镜与金属膜的界面会产生表面等离子波，当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数匹配时，金属膜内的自由电子会产生共振，即表面等离子共振体。

分析时，先将一种生物分子即配体（蛋白、抗体等）偶联在生物传感器表面，再将含有另一种能与靶分子产生相互作用的生物分子（分析物）的溶液注入并流经生物传感器表面。生物分子间的结合引起生物传感器表面质量的增加，导致折射率的变化，通过监测SPR的角度变化，可自动获得分析物的动力学结合和解离常数、亲和力及特异性等。生物分子间反应的变化即被观察到。

蛋白样品

EDC 氨基乙醇 Extraclean HEPES 缓冲的盐水缓冲液 HCl NHS 小鼠抗-TSH 单克隆抗体 兔抗小鼠-Fc 结构域 TSH TSH 稀释液

BIAcore 仪器 CM-5 传感芯片

第一阶段  捕获表面的制备和结合试验

材料

缓冲液和溶液
将贮存溶液稀释到适当的浓度。

EDC[0.2mol/L 的 N-乙基-N'-（二甲氨基丙基）-碳化二亚胺的水溶液]

氨基乙醇（1ml/L 盐酸乙醇胺，用 NaOH 调节至 pH8.5）

Extraclean
Extraclean 是一种用于表面再生的溶液, 可由 BIAcore 购得。

HEPES 缓冲的盐水缓冲液
10 mmol/L HEPES(pH7.4)
150 mmol/L NaCl
3 mmol/L EDTA
0.005%(V/V) 吐温-20
该缓冲液可以从 BIAcore 购得。

HCl(20 mmol/L)

NHS(0.05 ml/L 的 N-羟基琥珀酰亚胺水溶液）
EDC, 氨基乙醇以及 NHS 是由 BIAcore 购得的 Amine-coupling Kit 中的一部分

抗体



小鼠抗-TSH 单克隆抗体（lmg/ml，溶于 HEPES 缓冲盐水）
该抗体可以从 Alexon Trend,Inc. 购得。

兔抗小鼠-Fc 结构域 (RAMc)(30ug/ml, 溶于 l0 mmol/L 的 pH5.0 醋酸钠溶液)
该抗体可以从 BIAcore 购得。

TSH(20umol/L，溶于 HEPES 缓冲盐水）
TSH 可以从 Alexon Trend,Inc. 购得。

专用装置

BIAcore 仪器
该仪器包括 BIAcore 控制软件和 BIA 评价软件。
设备和软件可以从 BIAcore,Inc. 购得，相关的信息可査阅 www.biacore.com。

CM-5 传感芯片

方法

RAMc 通过伯氨基与 CM-5 传感芯片表面的结合
这一步要用约 45 min。通过下拉菜单或 BIAcore 控制软件工具栏中的图标来执行操作命令。

1. 将 CM-5 传感芯片模块嵌入 BLAcore 仪器。

2. 全部采用过滤并除气的 HEPES 缓冲盐溶液。

3. 将分别含有 NHS、EDC、乙醇胺和 RAM Fc 以及 20 mmol/L HCl 各 100 的小管置于 BIAcore 自动进样器架的适当位置。

4. 将一个空管置于 BIAcore 自动进样器架上。
如果采用的是 Immobilization Wizard，则可以进行这一步。(Wizards 是 BIA2000 和 BIA3000 中 BlAcore 控制软件 3.0 版本或更高版本的标准配制。）使用 Wizard 的话，按规定体积添加样品。结合 RAM Fc 的 RUs 目标数为 13000。

5. 开动仪器，以 5ul/min 的流速流过一个流动池。

6. 将 75ul 的 NHS 加入到一个空管中。

7. 在同一管中再加入 75ul 的 EDC。

8. 将含有 NHS 和 EDC 的小管中的成分混匀。

9. 注射 35ul NHS/EDC 混合物使表面活化。

10. 注射 35ul RAM Fc 到活化表面与抗体结合。

11. 注射 35ul 乙醇胺使过量的反应基团失活。

12. 快速注射 10ul 的 20 mmol/LHCl, 然后用 Extradean 除去非共价结合型材料。

13. 通过在开始注射 RAMc 前放置一个基线报道点，并在注射 20 mmol/L HCl 结束后 2 min 放置第二个报道点，来测定结合 RAMc 的水平。
固定 RAMc 的最终 RUs 值应该介于 10000 到 13000 之间；如果所得值偏低，可能是由于所用的 RAMc 浓度太低，或使用了贮存期超过 2 个月的 NHS 或 EDC 溶液。RAMc 的 RUs 值较低的表面仍然可以使用，但抗 TSH 的体积必须按经验进行调整；通常地，需要更多的抗-TSH 以达到期里的结合水平。

14. 关闭流动液，关闭命令窗口，保存报道文件。
在这时 BIAcore 可以处于预备（继续）状态，也可以在下一阶段直接使用表面。当缓冲液在仪器内保持流动时，RAMc 表面在机器里是非常稳定的。另外，芯片也可以拿出来保存在 4°C、含有少量水的 50 ml 锥形管中；以这种方式保存时表面可以稳定凡个星期。
检测抗-TSH 与 RAMc 表面的结合这一步要用约 20 min。通过下拉菜单或 BLAcore 控制软件工具栏中的图标来执行操作命令。

15. 开动仪器，使含有结合 RAMc 的流动池的流速为 10ul/min。

16. 注射 10ul 的 2ug/ml 抗-TSH(这需要总共 40ul 的抗-TSH 溶液）。
10ul 的抗-TSH 可以提髙约 250 个 KUs。如果 RAMc 表面的结含不能达到这种水平，再生（见第 17 步）并重复注射不同体积的抗-TSH，直至确定所需的注射体积。

17. 快速注射 10ul 的 20 mmol/L HCl，然后用 Extraclean 再生 RAMc 表面。

18. 为了测定结合到 RAMc 表面的重现性，用可以与抗 TSH 结合引起 250RUs 所需的体积重复注射抗 TSH。

19. 快速注射 10ul 的 20 mmol/L HCl，然后用 Extradean 再生 RAMc 表面。

20. 关闭流动液体，关闭命令窗口，保存报道文件。
检测 TSH 与捕获抗-TSH 表面的结合
这一步要用约 20 min。通过下拉菜单或 BIAcore 控制软件工具栏中的图标来执行操作命令。

21. 开动仪器，使含有结合 RAMc 的流动池的流速为 10pl/min。

22. 注射 10ul 的 2ug/ml 抗-TSH(或者注射第 15~20 步所测得的、与抗-TSH 结合引起 250RUs 所需的体积)。

23. 注射 25ul 的 200nmol/LTSH, 限定 120s 的解离时间（这需要总共 65ul 的 TSH 溶液)。120s 的解离时间就可以测得抗原-抗体复合物解离的速率。
注射约 20ul 的 200nmol/LTSH 以后，曲线会变平（斜率达到零)，表示在抗原和抗体分于间的相互作用达到瞬时稳态。如果曲线没有变平，就再生表面，并将第 23 步中 TSH 的浓度改为 400nmol/L 后，重复第 21~23 步（见图 18-26 和图 18-27)。

24. 快速注射 10ul 的 20 mmol/LHCl, 然后用 Extraclean 再生 RAMc 表面。

25. 关闭流动流，关闭命令窗口，保存报道文件。




第二阶段  抗原-抗体相互作用的动力学分析

材料

缓冲液和溶液
将贮存溶液稀释到适当的浓度。

HEPES 缓冲的盐水缓冲液或适当的冲洗缓冲液
10 mmol/LHEPES(pH7.4)
150 mmol/LNaCl
3 mmol/LEDTA
0.005%(V/V) 吐温-20
该缓冲液可以从 BIAcore 购得。

抗体

小鼠抗-TSH 单克隆抗体（lmg/ml, 溶于 HEPES 缓冲盐溶液）
该抗体可以从 Alexon Trend,Inc. 购得。
将抗体稀释到 2ug/ml 并制备 1000ul 或所需体积）来达到第一阶段第 15~20 步所测得的目标共振单位。

TSH(20umol/L，溶于 HEPES 缓冲盐溶液）
TSH 可以从 Alexon Trend，Inc. 购得。

制备一系列注射用 TSH 稀释液：

1. 制备浓度为 200、100、50、25、10 以及 5nmol/L 的不同稀释液，每一份均溶于 280ul 的流动缓冲液中用于实验。
2. 每个浓度按每份 70ul 分装于四个 7 mm 塑料小瓶中，每个小瓶加盖。
3. 将小瓶按样品循环参数的指示放置在 BIAcore 管架的适当位置。

专用装置

BIAcore 仪器
该仪器包括 BIAcore 控制软件和 BIA 评价软件。
设备和软件可以从 BIAcore,Inc. 购得，相关的信息可査阅 www.biacore.com。

CM-5 传感芯片，按第一阶段的介绍与 RAMc 结合。

方法

下列程序由三种方法模块或小段所组成：主程序、定义分析程序（DEFINEAPROG) 以及定义样品。注意一共有四个定义分析程序模块，在这四个程序中每一个均代表了主程序中的一部分（模块 1、模块 2、模块 3 以及模块 4)。当用软件编辑一个方法时，方法命令应釆用大写字母书写，用户所定义的参数用小写字母书写。

后跟感叹号（！）的部分注释仪器会认为是文字而非命令代码，会插入解释前一条命令的含义。

样本的要求

1. 通过等电聚焦或者使用软件预测，确定待分析蛋白的等电点。对等电点高于7或者小于3的蛋白一般不推荐进行 Biacore 分析，特殊需求可与相关技术人

员进行个例商讨。

2. 固定于传感片上的靶蛋白（例如：受体蛋白）和待分析蛋白，纯度要达到95％以上。

3. 用 PBS（或者用户蛋白所需的特殊缓冲液）对蛋白溶液进行透析，然后浓缩至 200ug/ml～1mg/ml 的浓度。

4. 化合物溶解在含 1‰ DMSO 的 HBS 缓冲液中，并稀释成  10-5M 和 10-6M 两种浓度进行初步分析；初步分析呈阳性的化合物再用含 1‰ DMSO 的缓冲液稀释成 10-5M， 5×10-6M， 2×10-6M， 1×10-6M， 5×10-7M 和 1×10-7M 的浓度梯度进行动力学常数分析。

5. 如果化合物无法溶解在含 1‰ DMSO 的 HBS 缓冲液中，则可以提高 DMSO的浓度，最高可至 1%的浓度。同时配制相应浓度的DMSO 缓冲液作为对照进行实验。

本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。