小胶质细胞原代培养实验

新生1-3d的仔鼠

含10%胎牛血清的DMEM培养基 D-PBS液 消化液(0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA)

37℃恒温摇床

1按照培养少突胶质细胞的方法，待10d后细胞分层生长。显微镜下可见满视野圆形、折光性强的小胶质细胞，附着在贴壁生长、紧密连接在一起、铺满培养瓶的星形胶质细胞层上面，甚至可见许多圆形小胶质细胞飘落在培养液中，此时可以开始纯化。

2.将培养瓶固定到37℃恒温摇床上，80-200r/min,振摇2h左右。

3收集振摇下来的小胶质细胞，种植到多聚赖氨酸包被的培养皿中，加入新的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每2-3d换液1次。

4.小胶质细胞在体外较难进一步分裂增殖，但如果根据实验需要传代培养，一种方法可以直接用细胞刮子刮下细胞，接种到新的培养皿中；另一种方法就是用0.25%胰酶+0.04%的EDTA消化后，进行传代。此方法获得的小胶质细胞，纯度可达90%-95%以上，可以用小胶质细胞特异性标志物F4/80、IBA1和IB4等进行免疫细胞化学染色进行鉴定。相差显微镜下观察，静息状态的小胶质细胞形态呈短小杆状或细长梭形等形态，带有2个或以上突起，折光性强，但是在激活和发挥吞噬功能状态下，小胶质细胞形态可发生巨大变化，胞体变大、变长或者变圆（图I--5)。

1.所有步骤要无菌操作．否则小胶质细胞有被污染或被微生物及毒素激活的可能。

2在振摇细胞之前，一定要确保底层的星形胶质细胞铺满培养瓶，并紧密连在一起，否则振摇过程中会将星形胶质细胞层摇起。

1.振摇分离出小胶质细胞后，将新的培养液加入原培养瓶中继续培养，数天后又会出现大量的小胶质细胞，如此可以重复甚至更多次振摇收集小胶质细胞。

2.由于小胶质细胞数目所占比例较小，在体外较难分裂增殖，故其产最不高。有文献报道可以采用营养缺失法或加入单核细胞集落刺激因子(M-CSF)以增加产量。作者在培养过程中加入了15%-30%L929条件性培养基。L929是一种成纤维细胞系，由于其分泌M-CSF,结果可获得充足的小胶质细胞。