4L分批式搅拌悬浮培养

D-PBSA 二氧化碳

抗泡沫剂

发酵培养瓶 生长培养基 内流式无菌微孔滤膜 磁铁搅拌子 电子细胞计数器或血细胞计数板

安装大搅拌瓶（Bellco，Techne）

(a)裹在玻璃摆内的磁铁或在顶盖（如 Techne）悬挂适合于替换的搅拌子



(b)1 个带有可移动 CO₂ 通透盖（即有完整微孔滤膜的盖）的入口，或者有硅酮横隔的盖，盖上插入 1 根粗孔针，通过 Luer 连接管将其同定到无菌的内流式滤器（如 Millex ) 上。

(c)第 2 个进入孔，带有气流管（如 Bellco # 1965)，管的内径为 2~3 mm，这个管几乎到达瓶的底部，但要保持搅拌时不与摆接触。外部入口与由铝箔保护的柔软 Luer 管相连。

(d)全部安装完毕后，在 100 kPa ( 15 lb/in² ) 压力下，用高压灭菌器将搅拌培养瓶消毒 20 min。但 CO₂ 通气盖要卸下来，分别灭菌。

1. 用 200 ml 培养液建立起始培养（见方案 13.3 )，按 5x10⁴~1x10⁵ 个/ml 的密度接种细胞。将培养物放在磁力搅拌器上，以 60 rpm 搅拌，直至培养细胞密度达到 5x10⁵~1x10⁶ 个/ml（注意：因细胞可发生凋亡，细胞密度不要超过 1x10⁶ 个/ml）。

2. 如图安装大搅拌瓶。



3. 向瓶内加入 4 L 培养液。

4. 用可处理的滴管或注射器向瓶内加入 0.4 ml 抗泡沫剂。

5. 用 CO₂ 通气盖关闭侧臂孔。

6. 将瓶放在磁力搅拌器上，置于 37℃暖房或培养箱中。

7. 通过无菌的微孔内流式滤膜，将 5% CO₂ 通气管连到气体入口的 Luer 管上。

8. 以 10~15 ml/min 的流速开放气体。

9. 以 60 rpm 搅拌培养液。 .

10. 将大搅拌瓶孵育 2 h ，使温度和 CO₂ 张力达到平衡。

11. 关闭 CO_2，将瓶与 CO₂ 管断开。

12. 将大搅拌瓶和起始培养细胞一起带回层流通风橱。

13. 将起始细胞缓慢地一次倒入大搅拌瓶中。

14. 将大搅拌瓶放回 37℃ 培养箱或暖房中。

15. 以 60 rpm 重新开始搅拌。

16. 再连通 5% CO₂ 通气管，将气流调整至 10~15 ml/min（如果通气管上没有流量表，可通过计数气泡估计流速）。

17. 将细胞培养 4~7 天，每天取样检査细胞增长率。

(a)将搅拌瓶带回层流通风橱。

(b)移去侧臂盖。

(c)吸取 5~10 ml 细胞悬液。

(d)计数细胞，通过染色排斥实验检査细胞的存活能力。

18. 当细胞浓度达到所需水平

(a)关闭通气管和磁力搅拌器。

(b)中断搅拌瓶的气体供应。

(c)把搅拌瓶带到实验室，将细胞注入离心培养瓶。

(d)离心（100 g，10 min )，按照用途收集细胞（从小滴）或上淸液。