125IUdR释放试验测定NK细胞活性

YAC-1细胞                                                          

125I-UdR（125I-2′脱氧尿嘧啶核苷）                                                                  胰蛋白酶                                                                  DNA酶                                                                  5-氟脱氧尿嘧啶核苷                                                                  RPMI-1640培养液                                                          

塑料试管                                                                  γ-计数仪                                                                  离心机                                                          

2. 胰蛋白酶：用无Ca2+、Mg2+的Hanks液配制成3mg/ml，小量分装，-20℃冻存。

3. DNA酶：用Hanks液配成50μg/ml，小量分装，-20℃冻存。

4. 5-氟脱氧尿嘧啶核苷（5-FudR）用生理盐水配制成1×10-3 mol/L，4℃冰箱保存。

5. 其余材料同上。

二、操作方法

1. 靶细胞的制备：取培养24～48h的靶细胞1ml（5×105 /ml），分别加入5-FudR 4～6μl和125I-UdR 6μCi，混匀，置37℃培养2h，取出后用含5%NCS的1640营养液洗涤3次，每次离心1500r/min，2min，最后用完全RPMI-1640培养液悬浮，计数活细胞。用γ-计数仪检测标记率，一般可达1～2cpm/细胞即可；

2. 效应细胞的制备：用常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，最后用完全RPMI-1640培养液悬浮并计数；

3. 效-靶细胞作用：调整效应细胞和标记的靶细胞浓度，分别加入塑料试管中，效/靶细胞比例为100:1。同时设只加标记靶细胞的自然释放对照管，每份标本和对照管均设3个复管，每管均用完全RPMI-1640培养液补足体积至1ml，混匀，离心1500r/min，2min，以促进效-靶细胞作用，置37℃，5%CO2温箱中培养18h。

4. 酶处理：取出效/靶细胞培养物，1500r/min离心2min，弃上清，于每管中加入胰蛋白酶和DNA酶各0.1ml，混匀后置37℃水浴30min，促使已受损伤的靶细胞释放125I-UdR，然后于各管中加入0.8ml冷Hanks液，以终止酶反应。1500r/min离心2min，分别吸出各管上清0.5ml置于另一个塑料试管中。

5. 放射性测量和结果计算：用γ-计数仪分别测量每管上清和细胞部分的cpm值，并按下式计算125I-UdR释放率和NK细胞活性，取三管均值作为NK细胞活性。

125 I-UdR释放率（%）= （0.5ml上清cpm值×2）/（0.5ml上清cpm值+0.5ml细胞悬液cpm值）×100％

NK细胞活性（%） =试验管125 I-UdR释放率 - 对照管125 I-UdR自然释放率。

一般要求125I-UdR自然释放率<10％，检测小鼠脾细胞NK活性用YAC-1细胞作为靶细胞时，检测前可不经过酶处理。

1. 该标记法需要长时间的孵育，用酶处理可增加方法的敏感性。

2. 要获得较理想的结果，关键在于对靶细胞标记前的代传处理。使细胞处于对数增长期的活力最佳状态，以达到最适的标记率和增强细胞对放射性同位素毒性作用的抗力，从而降低自然释放。

3. 因为如果发生污染就要丢弃培养的细胞，重新开始。

1. NK活性计算：

同位素释放%（NK活性）=（实验组cpm一自然释放cpm）/（最大释放cpm一自然释放cpm）X100

自然释放%=（自然释放cpm/最大释放cpm）x100

此结果中列出的同位素释放%,即代表NK活性。

2. 目前常用铬酸钠（Na51cro4）及125I一脱氧尿嘧啶核苷（125I-UdR）标记祛，两种方祛各有利弊。

51Cr优点：敏感、简便、流程短、重复性好，缺点为半衰期短、自然释放高。

125I-UdR优点：半衰期长、自然释放低、适于孵育时间较长的实验。缺点为敏感性较低、流程长。