1. 如何测定引物的OD值?
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,请注意紫外分光光度计的使用,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2~0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1 ml 并在1 ml 标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。
举例:您拿到一管干粉的DNA,用1ml水溶解成母液,取该母液50 μL 稀释成1 ml 并在1 ml 标准比色杯中测定的吸光度为0.25,说明该50 μL中含有0.25OD的DNA,也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
2. 怎样溶解引物?
生工的合成报告单给出了每OD引物稀释为100 μmoL/L(即100 pmol/ul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH7.5~8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000~4000转/分钟的转速下离心1分钟,防止开盖时引物散失。
3. 合成的引物应如何保存?
没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100 μmoL/L 的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液(10 pmol/ml或20 pmol/ml)后进行实验。
注意:工作液千万别用TE稀释,要用DEPC水,或去离子水稀释.因为TE可以鏊合镁离子,镁离子对Taq酶活性发挥至关重要,影响PCR反应。
4. 如何检测引物的纯度?
实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12~60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2 min)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600 V 电压进行电泳,一定时间后(约2~3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。
5. 一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基团吗?
没有,5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,订货时需特别注明。
6. 合成的引物进行PCR反应时无目的带,怎么办?
PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。
(1)引物和模板是否配对,同源性有多大?
(2)引物本身是否有立体结构.
(3)PCR反应用试剂是否能正常工作?
(4)PCR仪是否工作正常?
(5)PCR反应条件是否合适?
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1、质粒DNA提取提取质粒的时候,最后一步的酒精挥发很关键,基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间,最好是空调吹热风,或是37度温箱放长一点的时间,我试过室温过夜,酶切很好......
各种类型的软件都详细列出:1.三维分子类 22.DNA分析 33.RNA分析 34.蛋白质分析 45.生化教学 46.生化工程 47.序列格......