棉花转基因技术基因枪法花粉活体育种实例

中国农科院棉花研究所针对 20 多个棉花品种，成功建立了高效、稳定的规模化转化体系，以流水线的操作方式，建立了高效、工厂化的棉花转基因技术体系。本文援引中国农业科学院棉花研究所的发明ZL内容，以制备转 GAPDH 基因棉花的具体方法为例，以应用实例演示棉花转基因技术的具体应用案例。

土壤盐渍化是一个全球性生态问题，是当今世界土地荒漠化和耕地返化的主要因素之一，土地的盐渍化对农业生产和生态环境带来的影响巨大。植物耐盐是一个多基因参与控制的数量性状、多途径诱导的过程。植物适应盐胁迫的对策中较为普遍的是代谢调整。在胁迫条件下，植物本身能够感知和传导逆境胁迫信号，进而启动相关基因的表达，激活相应的保护代谢途径，如抗氧化酶系与洁性氧的清除，离子、代谢物的积累与渗透调节，胁迫诱导蛋白的合成及其防御功能，胁迫诱导基因的调控与表达。

自然界中存在着许多天然的耐盐植物，它们在漫长的进化过程中积累了很多丰富的耐盐基因。杜氏盐藻、红树、滨黎、海带、圣柳、蒺藜苜蓿、碱蓬、大米草等耐盐植物自身具有一套完善的耐盐机制。利用基因工程手段和分子生物学的方法克隆耐盐相关基因，转化棉花，大豆，小麦和玉米等重要经济作物，获得能在盐碱地上种植和栽培的农作物品种是未来研究的重点课题。

棉花转基因技术的具体实施方法

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

杜氏盐藻在文献"刘建国，吴超元.杜氏盐藻和自一胡萝卡素研究评价[J].海洋 与湖泊， 1995，26 (3):323-330. "中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定课题组实验室获得。

pGEM-T  EasyT4 载体购自 Promega 公司，产品目录号为 A1380 。

pBI121 在文献"香蕉 Maasr1 基因 RNAi 植物表达载体的构建及鉴定.热带作物学 报， 2009 年， 30 (3) :333-337. "中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定课 题组实验室获得。

基因枪为美国 WEALTEC 的基因枪 GDS-80 。

非抗虫棉花材料沪 749513 在文献"高频体细胞胚胎发生的优异棉花种质材料筛选.分子植物育种， 2012 ，10 (6) ，683-688. "中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究 所抗逆鉴定课题组实验室获得。

实施例 1、棉花转基因技术中 GAPDH 超表达载体的构建

一、设计 PCR 引物

引物序列如下:
GAPDH-F :5' -ATGGCTACATCAATGGCGAAGAC-3' ;
GAPDH-R :5' -TTAGGCGGCCCACCTCTGGGCG-3' 。

二、 PCR 扩增
(一) 提取杜氏盐藻的 RNA ，反转录成cDNA 。
(二) 以 cDNA 为模板，用引物对 GAPDH-F/GAPDH-R 进行 GAPDH 基因的 PCR 扩增。

PCR 扩增体系为:
Premix Ex Tag              25μl
模板                       2.0μl
GAPDH-F (10 μM)           2.0μl
GAPDH-R (10 μM)           2.0μl
ddH20                      补足至总体积 50μl。

PCR 反应程序如下:
94℃ 3min ;  94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 90s，35 个循环; 72 ℃ 10min ;4℃  +∞。

GAPDH 基因的核昔酸序列如 SEQ ID No.1 所示。
GAPDH 蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。

三、琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增片段并回收。

琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 1所示。

图1

图 1 中，1: PCR 扩增产物 ; 2: Marker
图 1 表明，PCR 扩增得到的 GAPDH 基因片段与预计大小一致。

四、将 GAPDH 基因片段与 pGEM-T EasyT4 载体连接，得到重组质粒。

五、将重组质粒转化大肠杆菌 DH5α ，挑单克隆进行测序，测序证明重组质粒正确。

六、提取重组质粒。以质粒为模板，以A和B为引物进行 PCR 扩增。

引物序列如下:

A :5' -CACGGGGGACTCTAGAATGGCTACATCAATGGCGAA-3'  ;
B :5' -AGGGACTGACCACCCGGGGGCGGCCCACCTCTGGGC-3'   。
(下划线所示序列为酶切识别位点)

七、用 Xba I 和 Sma I双酶切 PCR 扩增产物，得到 GAPDH 基因片段;用 Xba I 和 Sma I双酶切受体载体 pBI121，得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒 pBI121-GAPDH 。

八、将重组质粒  pBI121-GAPDH 转化大肠杆菌 DH5α，挑单克隆进行测序，测序证明重组质粒正确。

实施例 2、棉花转基因技术基因枪活体转化棉花

一、提取 pBI121-GAPDH 质粒。

二、转化受体材料为:非抗虫棉花材料沪749513。转化时间走在棉花的盛花期7月中旬到 8 月中旬，沪 749513 进行自交。

三、在转化的第一天下午采集各受体材料的花朵，然后将花朵室温放置实验台上(每个材料的花朵要做好标记)，同时己经去掉雄疏的花一定用蜡管套住柱头。

四、第二天早上9:00-10:00左右开始收集花粉，收集好的花粉放于干净的培养皿内，并做好标记。

五、取 10μl金粉和质粒的悬浮液加入到基因枪GDS-80孔内，用手轻轻拍打枪的加样孔附近两下，使所力口的样品完全进入枪内。

六、基因枪轰击采集的各受体材料的新鲜花粉1-2次，轰击后的花粉人工涂抹于雌疏的柱头（11:00 左右进行涂抹，此时花粉活力比较强），用蜡管重新套在涂抹花粉后的柱头上，以免发生杂交，挂牌做好标记。

七、待种子成熟，将收获的各材料的种子做好标记，晒干后脱绒保存。

图 2 是实验中基因枪大田转化的流程图片。

图2

图 2 中， A:大田棉花; B:去雄蕊，套蜡管，做标记; C:收集的花朵; D:收集的花粉; E:基因枪轰击;  F:授粉。

非抗虫棉花材料沪749513 T0代植株的棉花桃如图 3 所示。

图3

图 3 表明，经大田观察大部分转基因棉花桃比非转基因棉花桃稍小、有点畸形。转基因棉花吐絮晚。

实施例 3、棉花转基因技术转基因棉花T0代种子的分子检测

一、提取转基因非抗虫棉花材料沪749513 T0代植株的发芽材料的DNA 。

二、以各植株的 DNA 为模板，分别用 GAPDH 基因的两对引物进行扩增检测。检测引
物如表 1 所示。

表 1 检测引物

其中 GAPDH-F1 和 GAPDH-R1 为一对引物， GAPDH-F2 和 GAPDH-R2 为一对引物。

三、 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图 4 和图 5 所示。

图4

图 4 为 GAPDH 基因分子检测结果（以 GAPDH-F1 和 GAPDH-R1 为引物）。
图 4 中， M :Marker DL2000 ; 1-6 为沪 749513 T0 代植株。
图 4 表明，以 GAPDH-F1 和 GAPDH-R1 为引物扩增，图A中编号为 1、2 、3 、4 、5 和图 B 中编号为 6 的植株扩增出 992 bp 的特异性条带，其中编号为 3 和 6 的植株的特异性条带最清晰。

图5

图 5 为 GAPDH 基因分子检测结果（以 GAPDH-F2 和 GAPDH-R2 为引物）。

图 5 中，M :Marker DL2000 ; 1-20 为沪749513 T0 代植株。

图 5 表明，以 F2 和 R2 为引物扩增，图 A 中编号为 1-7 和图 B 中编号为 8-20 的植株扩增出 556 bp 的特异性条带，但条带不亮。

因此，通过两对引物扩增共检测出有特异性条带的植株（即转GAPDH基因非抗虫棉花材料沪749513植株） 26 株。

四、用图 4 中编号为 3 和 6 的沪 749513 转基因植株的 PCR 产物直接测序，结果正确，表明杜氏盐藻 GAPDH 基因成功转入了非抗虫棉花材料沪 749513 中。

实施例 4 、棉花转基因技术T0代种子的耐盐性测

采用双夹层滤纸法，具体步骤如下:

先在培养皿内放置一张滤纸，摆上种子，再在种子上放置一张滤纸，用0.8% (质量百分含量) NaCl水溶液浇之，溶液量以上层滤纸湿润、倾斜时皿底无溶液聚合为度，在 24 ℃ 保湿培养。 7 天后观察发芽情况。

实验组所用种子为实施例 3 中的 T0 代转 GAPDH 基因非抗虫棉花材料沪 749513 的种子 40 粒，对照组为未转任何基因的非抗虫棉花沪 749513 的种子 40 粒。

结果如图 6 所示

图 6

图 6 中，A:7 天后 T0 代转 GAPDH 基因非抗虫棉花材料沪 749513 的种子发芽情况；B :7 天后非抗虫棉花材料沪 749513 的种子发芽情况。

图 6 表明，T0代转 GAPDH 基因非抗虫棉花材料沪 749513 的种子中部分种子有较 强的耐盐性，发芽很好，发芽率达 16. 3%，而对照组非抗虫棉花材料沪749513 的种子耐盐性 明显较差，发芽率为 0.08%，对照组中有一个种子发芽，但是其根部发黑己死亡。转空载体 pBI121 的非抗虫棉花材料沪 749513 的结果与对照组一致。

参考资料：
叶武威;阴祖军;孔静静;王德龙;王俊娟;樊伟莉;王帅;. 一种制备转GAPDH基因棉花的方法: CN, CN103468655A[P]. 2013.