一、流式细胞仪的检测范围
1.流式细胞仪可以检测细胞结构,包括:细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、RNA含量、蛋白质含量。
2.流式细胞仪可以检测细胞功能,包括:细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
二、流式细胞仪的临床应用
1.流式细胞术在肿瘤学中的应用:流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡;
2.流式细胞术在血液学中的应用:检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞(CD34+)计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测;
3.流式细胞术在免疫学中的应用:可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。
三、流式细胞仪的科研应用
主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。
四、流式细胞术常规检测时的样品制备
(一) 直接免疫荧光标记法
取一定量细胞(约1×106 细胞/ml),直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入),孵育20~60分钟后,用PBS(pH7.2 ~7.4)洗1~2次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高,但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。
(二) 间接免疫荧光标记法
取一定量的细胞悬液(约1X106 细胞/ml),先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原-抗体-抗抗体复合物,以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。
五、质量控制和注意事项
流式细胞仪并非是完全自动化的仪器,准确的实验结果还需要准确的人工技术配合,所以标本制备需要规范,仪器本身亦需要质量控制。
(一)流式细胞术免疫学检测的影响因素和质量控制
流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用,其免疫荧光染色的标本制备非常重要,常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果。
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