光学显微镜有哪些种类和使用范围

1、双光路设计

　　以生命科学领域来说，绝大部分的光学显微镜都是单光路设计的显微镜;有一类显微镜，称之为，体式显微镜(Stereo Microscopes / Macroscopes)，或实体显微镜，或解剖镜，是双光路设计，即模仿人眼光路，对标本获取具有立体感的正像的显微镜。光路可见下图：

　　那体式显微镜，会为了不同的实验要求有不同样的配置，而且不同配置主要集中在光源的类型，和是否能观察荧光，当然，还有是否需要加装成像系统等。但与其他光学显微镜最大的区别在于，双光路设计;

　　2、单光路设计

　　除上述的体式显微镜以外，其他的光学显微镜，无论简单还是复杂，都可以被笼统地被划归到单光路显微镜这一大类，很大的类，超级大的类，里面来~~~

　　那在这个类别里面，我们再来细说：

　　2.1 正置显微镜

　　先上图，先一张 L 记家的正置显微镜 DM2500，局部大图用 O 记的 BX63：

　　其实，对于正置显微镜的判别很简单，你就看物镜和载物台的位置关系就可以了：

　　——如果物镜在载物台上方的，就是正置显微镜;

　　——如果物镜在载物台下方的，就是倒置显微镜(倒置显微镜后面会专门说，莫急莫催);

　　那有人问，L 记家的那个上面观察的地方，不也是两个黑枪口嘛，是不是就是之前说到的双光路设计?

　　非也，非也!

　　需要强调的是：

　　(1)在体式显微镜中，人家的双光路是从一开始的光源那里，就是独立的双光路，每个光路带着不尽相同的信息量的，看到的图像也是立体的;

　　(2)在正置显微镜中，光路从一开始的光源那里，就只是单光路;只是为了照顾要用两个眼睛观察的人类，才在光路快要结束的地方，用棱镜把一个光路拆成了两个光路，每个光路带的信息量，是相同的，看到的图像也只是平面的;

　　那么对于应用来说，正置显微镜受限于物镜到载物台之间的距离，主要用来观察病理切片等薄的样品标本;再次强调，特殊的应用，我们这里暂时不提;

　　2.2 倒置显微镜

　　还是先上图，以 N 记 TS100 为例：

　　还记得超级简单的分辨标准吗?看物镜和载物台的相对位置——物镜在载物台下方的，为倒置显微镜;至于是单光路显微镜，还是双光路显微镜，请参考上面正置显微镜部分;

　　对于倒置光学显微镜来说，虽然物镜到载物台的距离已经不会很远，但是，你要知道，物镜在载物台下面啊，亲!载物台上方的空间好大的呀!你不仅可以放切片，放培养皿，而且可以放培养瓶，多孔板，甚至你可以考虑把活体小动物固定在上面(生动画面请自行脑补)

　　至此，对于光学显微镜的最基本的分类就差不多了，但是，还有一些小问题需要在这里做补充：

　　(1)上面所有提到的光学显微镜，所使用的光源，都是面场光源，比如卤素灯、汞灯、汞氙灯、LED 等，等等等等;

　　(2)为了实验应用，聪明的人类啊，搞出来了很多种观察方式，一般归类七种，明场(Bright Field)，暗场(Dark Field)，相差(Phase Contrast)，相衬(Relife Contrast)，微分干涉(Differential Interference Contrast)，偏光观察(Polarising Observation)和荧光观察(FL)——每种观察方式的成像原理和光路结构是不同的;

　　虽然有人愿意按照观察方式对显微镜进行分类，但是，个人觉得没意义：因为一台显微镜又不是只能实现一种观察方式，能看 BF 的，说不定也能看 PH，还能看 FL， 你说算哪个?

　　(3)至于有提及按照单目、双目、三目来分，可以这样分类，但是会有很大的局限性：首先，单目光学显微镜已经很少见了，超级普遍都是双目显微镜标配;其次，那所谓的三目，就看用户是否需要外接成像系统进行显微图像的数码采集，如果需要，就是三目;可见下图，还是以 O 记为例：

　　BUT，对于 PART TWO 中提到的一些显微镜，你就没有办法按照这个标准进行分类了，因为，那些系统对于显微图像的数码采集的设备是标配，是默认的，是在机器系统里的;

　　PART TWO

　　在上一部分最后，有强调了一下使用面场光源的显微镜，其实也就是，会有显微镜使用的不是面场光源，比如点光源。我尝试着说一说。

　　1、激光扫描共聚焦

　　先上图(Z 记的 LSM)：

　　这里举例的是激光扫描共聚焦(Laser Scanning Confocal Microscopy);光源是激光(点光源)，成像是靠点构成线，线构成面这样扫出来的，共聚焦嘛，就涉及到光路结构了，大家可以参考下图，自行理解;但是，从上图中，大家可以看出，激光扫描共聚焦要是参考 PART ONE 的分类来看，就比较不那么容易了——可以在正置显微镜上做，也可以在倒置显微镜上做;

　　2、双光子

　　我就直接“借用”百度百科的解释(双光子显微镜_百度百科)：双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜[1]使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

　　　3、应用

　　无论是激光扫描共聚焦还是双光子，主要还是要看标本的荧光信号，从差别上说：

　　(1)在一定深度范围内，激光扫描共聚焦可以剥离掉非焦平面的荧光信号，在最大程度上保证你所采集到的都是在焦面层面的清晰信号，获取高质量的荧光图像;

　　(2)在更深层面的范围内，双光子更进一步的排除掉各方面的干扰，更进一步地帮助你获取深层次的荧光信号图像;若要将激光扫描共聚焦和双光子做对比，可以参考下图(其中，红色是激光扫描共聚焦采集到的信号，最深也就 110 微米;绿色的是双光子采集到的信号，最深 300 微米;Z 轴表明深度;)