细胞衰老如何应对

近年来，细胞体外培养造成细胞衰老的报导中指出，所有动物细胞皆有其本身的『海佛烈克极限』，影响其生物寿命长短。从细胞代数学说（也称细胞分裂次数学说）认为，人体细胞在培养条件下平均可培养60代。也就是说，无论是原代细胞或是细胞株，在细胞培养过程中细胞衰老现象是存在且常见，但却容易被操作人员忽略，往往在细胞出现不增殖或是形态明显改变，才开始意识到细胞衰老的存在！

海佛烈克极限是什么？

上世纪60年代初，海佛烈克（Leonard Hayflick）提出的『海佛烈克极限』，当时他观察到实验室使用的正常的人类细胞不能无限地分裂，而是有其极限。经进一步研究证实，不管是来自胎儿还是成人的多种类型细胞，大约都只能分裂40-60次，就会停滞不分裂或者出现细胞凋亡而死亡，海佛烈克认为细胞分裂能力的限制和细胞的衰老有关。80 年代随着科学家对染色体末端具有维持染色体结构稳定性的端粒（telomere）结构的深入了解，逐渐发现端粒DNA会在每次细胞分裂（mitosis）时，末尾的5’端处会有一小段序列没办法被复制而变短，同时也缩短细胞「生命时钟」寿命。

细胞衰老（Cellular Senescence）

随着每次细胞增殖，DNA复制端粒DNA会逐渐变短，进而产生细胞染色体组成不稳定，使细胞进入凋亡期。

细胞衰老的常见表现

1.细胞生长缓慢 ：细胞周期缓滞或是停滞都是衰老细胞的基本特征，此时细胞周期主要停滞于G1期。

2.表面分泌物会增多：细胞衰老时显微镜下可见小黑点，但是小黑点增加，也有可能与培养条件如pH，血清浓度，生物污染等有关。

3.细胞形态改变：如细胞体积增大、细胞扁平、胞核与核仁体积增加，如果是贴壁细胞，其细胞表面会明显观察到比较脏，运用常规HE染色结果会发现，细胞表面有很多附着的脏物，细胞形态与刚开始培养的细胞外观明显不同，像是上皮细胞等可能会出现很多梭状形态，且细胞质突起等形状异常细胞。

4.细胞质中出现空泡：衰老细胞的细胞器发生变化，如高尔基体和溶酶体数量增多、体积增大，导致细胞质内颗粒明显增多。

【衰老的细胞体积增大、细胞扁平、SA-β-gal染色阳性】
细胞培养时可能导致衰老的原因
 

1.细胞传代次数比较多，一定要控制细胞传代次数！大量扩增细胞，将细胞进行冻存，在必要的时候重新复苏。

2.胰酶消化时间太长，胰酶消化时间过长容易导致细胞状态不佳以及胞质疏松;细胞传代时需要留意胰酶消化的时间。消化过度，在消化细胞时会对细胞的表面蛋白有较强的损伤，所以消化的时间不能过长，建议使用合适浓度和pH值的消化酶，否则会导致细胞衰老和分化。

3.细胞密度过高或过低，细胞过密产生接触作用，导致细胞的活力减弱以及细胞增殖减慢，最后出现衰老。

4.长时间未更换细胞培养基

5.使用劣质细胞培养试剂，使用合适的血清和培养基，不同的细胞对培养基或是血清的要求不同，所以筛选最适合细胞培养的血清和培养基，预防细胞衰老，维持细胞正常生长。

细胞衰老的检测
 

1.检测端粒功能，分析检测细胞端粒序列的长度和端粒逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)的活性来评估端粒的功能（高表达的端粒逆转录酶，使得端粒的长度不会随DNA复制而缩短，让细胞获得持续分裂的能力）;但此检测方法很难成为常规标准分辨细胞衰老，主要原因是因为无法建立一致性的标准，在不同物种之间细胞发生衰老时，其端粒长度不具有可比性; 即使来源于同一物种(如人细胞)。

2.DNA损伤检测，在衰老细胞中会启动DNA 损伤信号p53，细胞衰老通路p53是被细胞DNA损伤而受到DNA损伤回应(DNA damage response, DDR)通路的激活。

3. β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase, SA-β-gal)活性染色，β-半乳糖苷酶主要位于溶酶体， 当细胞衰老发生时， 溶酶体膨胀并且增多， β-半乳糖苷酶明显积累在溶酶体中， 因此SA-β-gal染色法为检测细胞衰老最普遍常见的指标。不过在一些特殊情况下，例如，血清饥饿引发的细胞休眠(quiescence)也会出现SA-β-gal染色呈现阳性。
 

4. 流式检测细胞周期，此方法学可明确观察到培养的细胞群体中处于不同周期细胞的比例，在出现细胞衰老时细胞周期主要表现为G1期停滞，部分特别情况下会伴随G2/M期周期停滞或直接由G2/M期停滞诱发形成。

【衰老细胞的鉴定，许多种标志物、表征、形态和蛋白质等有关的细胞衰老检测。】

细胞衰老是否可逆？

上述的原因我们了解到大部分细胞衰老信号通路的启动，细胞衰老最基本且最重要的特征『不可逆的细胞周期停滞』，与休眠细胞不同部分，就是衰老细胞无法借由传代等方式重新进入细胞周期。细胞培养过程，防止衰老不二法门：还是要做到勤观察、勤换液、勤传代、勤保种，特别是传代，不能等细胞太密了之后传，一般细胞长到70－80％传代最好，尽量不要超过90％。一旦细胞衰老后，细胞很难再重新年轻化，此时，只能重新复苏细胞。