中国学者首次详细发表冠状病毒等的检测方法

　　由病毒或细菌引起的呼吸道病毒感染是全球人类最常见的疾病之一，而由新兴病毒引起的疾病则是造成新型感染的疾病，例如最近导致中国武汉爆发肺炎的新型冠状病毒2019-nCoV，对全球公共卫生的产生巨大威胁。识别呼吸道病毒感染的致病性病原对于选择适当的治疗方法，挽救人们的生命，停止流行病以及避免不必要地使用抗生素很重要。常规诊断测试，例如用于快速检测抗病毒抗体或病毒抗原的测定法，已在许多临床实验室中广泛使用。随着现代技术的发展，包括多重核酸扩增和基于微阵列的测定在内的新的诊断策略正在出现。

　　2020年1月15日，复旦大学姜世勃等人在Journal of Medical Virology 在线发表题为“Recent advances in the detection of respiratory virus infection in humans”的综述文章，该综述总结了用于检测常见呼吸道病毒【例如流感病毒，人呼吸道合胞病毒（RSV），冠状病毒，人腺病毒（hAdV）和人鼻病毒（hRV）】的当前可用和新颖的诊断方法。还描述了用于同时检测多种呼吸道病毒的多重测定。预计这些数据将有助于研究人员和临床医生制定适当的诊断策略，以便及时有效地检测呼吸道病毒感染。

　　1.介绍

　　急性呼吸道疾病（ARD）在全世界所有急性发病率和死亡率中占很大比例，其中急性病毒性呼吸道感染是主要原因（约80％）。主要病毒病原体包括流感病毒，呼吸道疾病合胞病毒（RSV），冠状病毒，腺病毒和鼻病毒。在5岁以下的儿童中，仅流感和RSV的全球总死亡率每年就达到300,000例死亡。其他呼吸道病毒（如腺病毒和鼻病毒）的死亡率较低，但发病率很高，造成了巨大的经济负担。 可能引起流行病或大流行的高致病性新兴和复发性冠状病毒，例如严重的急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），已对全球公共卫生构成了巨大威胁。最近，一种新颖的冠状病毒2019-nCoV（https://www.who.int）导致严重的公共卫生事件。该冠状病毒的完整基因组序列已于2020年1月10日发布，与SARS-CoV和蝙蝠型SARS冠状病毒（SL-CoV）超过82％序列相似性。

　　对致病性病毒病原进行准确，快速的诊断对于选择适当的治疗方法，挽救人们的生命，制止流行病并减少不必要的抗生素使用非常重要。上述所有病毒均可引起上呼吸道感染和下呼吸道感染，以及重叠的临床表现，如果没有扎实的实验室分析，医生很难区分病原体。常规的诊断方法，例如病毒培养和直接/间接免疫荧光测定（IFA），既费时又费力，而且灵敏度有限。快速，准确地诊断呼吸道病毒可以帮助进行流行病学监测，以及采取有效的预防措施和实施适当的抗病毒治疗。在过去的几十年中，从常规方法到快速抗原检测，病毒诊断测试一直在发展。最近，已经开发出高灵敏度的核酸扩增试验（NAAT）和即时检验（POCT）。

　　在这篇综述中，研究人员描述了目前可用于诊断人类呼吸道病毒感染的各种方法。 预计这些数据将有助于临床实验室快速准确地诊断呼吸道病毒，从而为医生提供及时和适当治疗患者的基本信息。该综述总结了常用的流感病毒，RSV，冠状病毒，腺病毒和鼻病毒的诊断方法，并在下面的评论中进行了详细描述。

　　2.流感病毒及其诊断方法

　　流感病毒属于正粘病毒科。 该家族由五个属（甲型流感病毒，乙型流感病毒，丙型流感病毒，Thogotovirus和Isavirus）组成，它们根据内部核蛋白（NP）和基质（M）蛋白进行分类。 在这些属中，仅甲型和乙型流感病毒引起临床疾病。 乙型流感病毒感染通常引起局部性暴发，而甲型流感病毒是人类感染的主要病原体，因此是大流行性流感的主要原因。基于糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）， 甲型流感病毒位于病毒表面，分为多种亚型。 到目前为止，已鉴定出18种HA（H1-H18）和11种NA（N1-N11）亚型。已使用许多诊断方法，包括病毒分离以及一些新兴的基于分子的方法来检测发生流感的病毒种类。

　　3.人类呼吸道合胞病毒及其诊断方法

　　人RSV是副粘病毒科的无节段，负义和单链RNA病毒。RSV的基因组包括十个编码11种蛋白质的基因。根据基因组序列和单克隆抗体（mAb）对表面糖蛋白（G）和融合蛋白（F）的反应性，RSV可以分为A和B组。RSV是导致严重呼吸道疾病的主要原因。免疫功能低下的人群，例如婴儿和老年人群，在全球范围内具有很高的发病率和死亡率。早期和准确的RSV诊断对于适当的治疗至关重要。

　　4.冠状病毒及其诊断方法

　　冠状病毒属于冠状病毒科。蝙蝠已被公认是各种冠状病毒的天然宿主和载体，并且该病毒已经越过物种壁垒感染人类和许多其他种类的动物，包括鸟类，啮齿动物等。冠状病毒可能引起呼吸系统疾病和神经系统疾病。到目前为止，已鉴定出六种人类冠状病毒（HCoV），包括HCoV-229E，HCoV-HKU1，HCoV-OC43，HCoV-NL63，严重急性呼吸综合症冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合症冠状病毒（ MERS-CoV）【注：新型冠状病毒2019-nCoV没有统计在内】。

　　MERS-CoV是一种人类冠状病毒，于2012年6月首次报道，可引起人类呼吸系统疾病，它被归类为Cβ-冠状病毒谱系，其结构包含约30 kb的正向链，人类MERS-CoV与MERS-CoV来源于骆驼具有超过99.5％的核苷酸同一性，这表明人和骆驼分离物属于同一冠状病毒物种。截至2019年9月30日，实验室确认的2468例MERS-CoV感染病例，包括851例死亡。由于目前尚无用于MERS的商业疫苗或治疗方法，因此快速准确地诊断MERS-CoV对于预防其传播和暴发非常重要。

　　当前对冠状病毒的诊断测试包括RT-PCR，实时逆转录PCR（rRT-PCR），逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）以及实时RT-LAMP。

　　基于靶向SARS-CoV和MERS-CoV保守的S2基因的引物和探针，开发了一种RT-PCR方法。通过使用pUC57SARS-pS2作为SARS-CoV的模板和pGEM-MERSS2作为MERS-CoV的模板，可以实现50-100拷贝/ mL的足够检出限。设计了单重RT-iiPCR检测MERS-CoV包膜基因（upE）和开放阅读框1a（ORF1a）基因分开。与参考单重RT-qPCR检测相比，单重MERS-CoV ORF1a和upE RT-iiPCR检测的灵敏度分别为99.03％和100％。

　　有六种基于rRT-PCR的市售MERS-CoV RNA检测试剂盒，包括AccuPower（韩国Bioneer），Anyplex（韩国Seegene），DiaPlexQ（韩国Solgenent），LightMix（瑞士罗氏分子诊断公司），UltraFast试剂盒（韩国Nanobiosys）和PowerChek（韩国Kogene Biotech）。 因此，上述六种rRT-PCR试剂盒的整体灵敏度和特异性足以诊断MERS-CoV感染。

　　在RT-LAMP分析中，构建了两套引物，其中一套针对N基因，一套针对ORF1a基因。两组都显示了高效扩增来自不同MERS-CoV株的靶序列的效果，并且与其他呼吸道病毒没有交叉反应。Huang的研究小组已经建立了一种将RT-LAMP技术和垂直流相结合的核酸可视化技术。可视化条（RT-LAMP-VF）检测MERS-CoV的N基因。RT-LAMP-VF检测方法与多个SARS相关CoV（包括HKU1，HKU4，OC43和229E）无交叉反应的RNA，因此具有很高的特异性。

　　上面提到的RT-LAMP和RT-LAMP-VF是用于快速准确检测MERS-CoV感染的检测方法。 Bonhan Kooa的团队设计了一种拱形多目标传感器，该传感器能够通过在临床样品中直接扩增来快速鉴定病原体。该方法能够以高灵敏度和特异性检测包括MERS-CoV在内的多种病毒，并且能够在20分钟内将临床样品中的MERS-CoV与HCoV区分出来。

　　5.人腺病毒及其诊断方法

　　腺病毒（AdV）感染现在被视为人类或动物发病率和死亡率的重要来源。人腺病毒（hAdV）感染很容易传播，可感染所有年龄段的人群，尤其是婴儿和老年人，以及具有免疫缺陷和器官移植的人群。HAdV具有直径70至100nm的无包膜球形结构。外壳由252个帽壳组成，包括240个六邻体和12个Penton，由二十面体病毒衣壳组成。帽体排列在20个三角形表面上，使壳形成30个边和12个顶点。hAdV的基因组以线性双链DNA的形式存在于衣壳中，大小从34到37 kb以上不等。HAdV属于腺病毒科，已经被分类。根据六邻体和纤维蛋白特性，相对核酸同源性，免疫化学反应，生物学特性和系统发育关系分为7种（A至G），具有50种以上血清型。该细分具有一定的临床意义，主要是因为不同的hAdV在组织方向和疾病类型上有所不同。HAdV可引起多种疾病，例如呼吸系统疾病（hAdV-B，-C和-E），肠胃炎（hAdV-F和-G），角膜结膜炎（hAdV-B和-D）和脑膜脑炎（hAdV-A， -B和-D）。因此，在hAdV进展之前对其进行有效，快速的诊断将提供对hAdV感染的有效监测，并确保及时有效地治疗与hAdV相关的疾病。

　　6.鼻病毒及其诊断方法

　　鼻病毒（RVs）是属于Picornaviridae肠病毒科的RNA病毒，已被分类为3种（A至C），具有超过160种血清型。RVs是具有二十面体对称的小型单链RNA病毒。RVs是儿童和成人中最常见的呼吸道感染原因。RV-A和RV-C是常见的RV种类，可引起下呼吸道疾病，喘息和急性哮喘，与儿童相比，它们可能导致比RV-B更严重的症状。

　　病毒的培养分离和酸稳定试验相结合是RV诊断的经典方法。但是，该测定费时且费力，从而限制了其在临床治疗中的价值。可以通过免疫学方法检测人RV抗体。但是，由于缺乏合适的交叉反应抗原来覆盖大量RV血清型，这些方法的应用受到很大限制。相比之下，一步式实时PCR分析通过使用序列检测RV。该测定法改善了工作流程，减少了准备时间，并消除了从逆转录反应步骤中cDNA可能引入的交叉污染。半嵌套式RT-PCR测定法基于一种极其灵敏的PCR方法，可检测空气传播的RVs的检出限（LOD）约为0.8。随着全基因组测序（WGS）技术的迅速发展，越来越多的实验室可能在临床上对人RV分离株进行WGS 。随着hRV-C的发现，全基因组hRV测序的数据量已大大增加和改善。这将有助于研究人员和临床医生了解RV的进化和重组，可以改善诊断。

　　7.多重呼吸道病毒检测

　　尽管可以在有症状的患者中检测到单个呼吸道病毒，但其他呼吸道病毒也可能同时存在。儿童，尤其是五岁以下的儿童，发生共感染的频率更高。在单个试管中包含多个病毒基因靶标的多重测定法具有快速检测几种潜在病毒病原体的优势。同时。多重实时PCR已允许在短时间内同时检测多种呼吸道病毒。与单重方法相比，多重诊断方法具有更高的样品通量（每次运行96个样品），更短的周转时间（5h）和更少的样品需求量。

　　8.结论

　　在全世界所有年龄组中，呼吸道病毒都是症状性呼吸道感染的主要原因。对这些病毒的及时，准确的诊断可以对感染进行适当的治疗。总结了几种常见的呼吸道病毒（如流感病毒，人RSV，冠状病毒，hAdV和鼻病毒）的传统和现代分子诊断方法，以及它们的优点，缺点和原理。但是，这些呼吸道病毒容易因病毒基因中的点突变而引起抗原漂移，基因重排可能导致具有大流行潜力的新菌株。所有这些继续对快速准确地检测人类呼吸道病毒感染提出了新的挑战。

　　因此，鉴定病毒基因组内的突变是非常必要的。但是，为查明人类呼吸道病毒的基因突变所做的努力依赖于使用Sanger测序对单个基因或基因家族进行高通量测序。尽管这种方法取得了丰硕的成果，但Sanger测序的成本和通量通常禁止构成外显子组的〜22,000个基因的系统测序。 NGS技术的最新发展通过提供以相对较低的成本快速测序外显子组，转录组和基因组的能力，改变了这种范例。 NGS在呼吸道病原体的诊断和鉴定中的应用，特别是对于重症肺炎或不明原因感染的患者，越来越受欢迎。与传统方法相比，NGS具有检测重症肺炎患者中合并感染的能力，并且在诊断重症肺炎中表现良好。作为一种不经常循环的基因型，病毒株整个基因组的表征将促进对其流行病学和致病性的进一步研究，并有助于诊断新出现的呼吸道病毒。 WGS可以更好地识别传播事件和爆发，这在亚基因组序列中并不总是可能的。

　　参考消息：

　　https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/jmv.25674