诱导动物细胞融合的方法

　　为什么灭活的仙台病毒能作细胞融合的诱导剂？

　　问题的提出

　　在新冠肺炎疫情下，科研人员加紧在研究新冠病毒（SARS－CoV-2），不断有新的研究成果产生，如要彻底了解该病毒的结构和侵染机理，还需要一段时间，甚至可能要较长的时间。要知道，人类与病毒的斗争看不到尽头，仅仅是认识第一个病毒－烟草花叶病毒，就花了41年的时间。只有搞清楚病毒的结构和侵染机理，才能有找到或研制相应的药物治疗和疫苗来预防。

　　问题：动物细胞的融合过程中常用的生物诱导剂是灭活的仙台病毒，仙台病毒是怎么样的一种病毒？为什么仙台病毒能诱导动物细胞的融合？

　　01

　　诱导细胞融合的方法

　　动物细胞的融合原理是细胞膜具有一定的流动性，诱导细胞融合的方法有三种：生物方法－病毒、化学方法－聚乙二醇（PEG）、物理方法－离心，震动，电刺激。

　　生物方法可以用某些病毒，如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活此类病毒后诱导细胞融合。

　　化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。

　　02

　　细胞融合技术的发展过程

　　生物方法融合：

　　1957年， 冈田善雄意外发现仙台病毒（HVJ），能诱导悬液中小鼠艾氏腹细胞（EAC）融合。然后Harris、Kada等用于诱导种间细胞融合，获得成功。

　　化学方法融合:

　　1972年，卡尔森首先用硝酸钠进行烟草两个种的细胞原生质体的融合，1974年Kao等，首先发现聚乙二醇（PEG）能诱导植物细胞原生质体融合产生杂交细胞。

　　1975年Pentecorvo发现PEG也能帮助哺乳类动物细胞的融合，1976年，Davidson更进一步证实这一结果，并且认为其具有简单快速、高效率等优点。因而，1975年之后聚乙二醇就逐渐取代了仙台病毒。

　　电融合法电融合法:

　　70年代未期和80年代初期发展起来的一种新的细胞融合方法。1970年，Senda首先应用电脉冲， 通过微电极在显微镜下使植物细胞融合，奠定电融合技术基础。

　　激光诱导卵细胞融合:

　　激光诱导方法是最新的细胞融合方法，该法为张闻迪等人在1988年首先应用，他们利用激光微束的单色性、高功率密度、短脉宽和极小的作用范围等特点。对泥鳅受精卵进行融合试验，获得成功，且融合后的细胞可存活发育，经卵裂期、囊胚期、原肠期、孵化期、直至幼鱼。整个过程可通过显微镜观察，还可同时由电视摄象监视器观察和进行照相记录。

　　03

　　仙台病毒及其促融原理

　　仙台病毒属于副黏病毒科呼吸道病毒属，仙台病毒最早在日本仙台一实验室分离出来，为单股负链RNA病毒（一方面复制产生正链RNA，另一方面可以转录出mRNA），直径100～200nm，具有相对坚固的核衣壳，外面包有布满长8～15nm，宽2～4nm纤突的含脂蛋白囊膜。（图注：有染色体是因为RNA和有些蛋白质发生了结合）

　　啮齿类动物是仙台病毒感染的自然宿主，大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠自然条件下均可感染，新生乳鼠和未成年小鼠最为易染，可引发严重的肺炎，并在3-4天死亡。病毒主要通过直接接触和空气传播传染，由呼吸道进入体内，在上呼吸道进行复制后进入气管和支气管中感染。

　　几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。被感染的细胞株很易引起继发感染。因为具有融合各种细胞的能力，所以被广泛地用来进行细胞的异核体形成和培育杂种细胞。

　　1.促进细胞融合的基本原理

　　灭活的仙台病毒无感染力，但有抗原性。所谓灭活的HVJ是RNA已经完全失活，只留下细胞膜融合能力的衣壳蛋白包膜活性。仙台病毒的HN蛋白可与细胞膜外的受体结合，通过F蛋白的作用，引起细胞膜融合。

　　在HVJ－E中，仙台病毒的基因组RNA已经完全失活，在人类和实验动物体内不存在感染或增殖。因而不需要特殊的操作和设备，它可以安全地在普通的实验室使用。

　　基本原理在于仙台病毒含有细胞表面受体的结合位点，通过细胞表面吸附（步骤1），细胞通过HVJ-E相互连接（步骤2），可以促使不同细胞凝聚，最终使细胞膜利用强疏水性结合力进行相互融合（步骤3）。直接产生这种作用的部位是HVJ病毒的外壳，而不是内部的RNA。

　　但是应用HVJ技术有很多缺陷，如细胞感染率低，融合速度慢，反应条件高，融合体的去病毒困难等。目前的细胞融合技术主要采取聚乙二醇（PEG），电刺激融合等技术。

　　2.仙台病毒诱导细胞融合的四个阶段（悬浮法）

　　（1）两种动物细胞或原生质体在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上，并使两细胞相互凝聚。

　　（2）在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破坏，此时需要Ca2+和Mg2+，最适pH为8.0－8.2。

　　（3）细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP。

　　（4）两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一个巨大细胞，仍需ATP 。

　　（5）进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。

　　另外，仙台病毒除了可广泛用于基因治疗用载体，还可用于构建活载体疫苗。仙台病毒载体在疫苗上的应用主要是基于其能够激发较强的细胞免疫，可用于传统方法无法实现的疫苗。