超滤离心管的常见问题有这些？

超滤离心管的常见问题与解答

一：超滤离心管的膜材质是什么？

密理博超滤离心管的膜材质为默克密理博特有的Ultracel再生纤维素膜，生产工艺严格，截留分子量明确而，蛋白吸附损失zui小。

二：如果要用超滤离心管的方法分离两种蛋白，那么这两个蛋白的大小需要相差多少？

按照经验，建议两个蛋白的分子量要相差一个数量级（10倍）

三：密理博超滤离心管可以用于病毒浓缩吗？

可以。对于慢病毒推荐Amicon Ultra 100KDa；对于腺病毒推荐Amicon Ultra 50KDa。具体的操作步骤可以参考病毒浓缩纯化试剂盒FTLV00003和 FTAV00003的产品使用说明书。

四：密理博超滤装置是否可以用于高压灭菌？

Amicon Ultra都是采用热封设计，不可以用于高压高温灭菌。

五：超滤离心管可以用酒精消毒灭菌吗？

Amicon Ultra与70%乙醇是兼容的中，但是对灭菌处理的具体方法没有做相关的测试，所以无法提供更进一步的参考信息。

六：超滤离心管含不含RNA酶？

不保证超滤离心管不包含RNA酶，建议用0.1%DEPC在37度浸泡2小时，以完全灭活RNA酶；残留的DEPC可以用Milli-Q超纯水洗涤除去。

七：用超滤离心管去除去污剂是有什么需要注意的吗？

去污剂因其独特的性质，当浓度大于临界微团浓度（Critical Micelle Concentration、CMC）时，去污剂分子会聚集形成微团而改变分子构象，这有可能会影响去污剂的去除效果，具体的操作步骤请垂询默克密理博。

八：蛋白在浓缩时出现了沉淀，如何改进？

蛋白浓缩过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后的zui终浓度不超过20mg/ml。对于对浓缩速度敏感而容易沉淀的蛋白，建议的方法是1）离心力降为推荐离心力的30%-50% 2）改用截留分子量更大的超滤管（如原本选用10K，此时可以选择30K） 3）在浓缩过程中取出超滤管，用枪头反复吹吸几次后再继续浓缩。

九：浓缩后发现浓缩液中没有目的蛋白，可能的原因有哪些？

首先，Amicon Ultra超滤管的蛋白zui低起始浓度为25ug/ml。请确保样本的起始浓度大于这个浓度。其次，如果问题仍然出现，请不要丢弃样本滤过液以便用于分析可能的原因：

1）如果目的样本在过滤液中，那么请排查 ：a）是否选择了合适截留分子量的超滤管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3） b）使用的离心力是否在限定范围内？如果使用的是rpm，请换算成相应的g离心力。c）离心机zui近是否有校准过？d）是否尝试这个蛋白？如果能确保用同样的超滤管对其它蛋白成功操作的话，那么有可能是这个目的蛋白的原因。有时蛋白会因其本身的一些特性（构象差异）而影响浓缩效果，建议选用上一分子量级别的超滤管（如原本选用30K，此时可以选择10K）。

2）如果目的样本也不在滤过液中，那么：a）蛋白样本起始浓度是否大于25ug/ml？b）用来确定样本浓度的方法是什么？是否可信？ c）目的蛋白是不是沉淀了？如果是，具体解决方法请参考上面的关于蛋白沉淀问题的解释。

十：有时候用超滤离心管连水都离不下来，可能是什么原因？

超滤离心管超滤膜中含有微量甘油。如果出现这种情况，请先用0.1N NaOH清洗再离心。zui后用缓冲液或Milli-Q水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。

十一：说明书推荐在室温下进行离心，考虑到蛋白的稳定性，是否可以在4 摄氏度进行离心?

可以,但是低温会增加蛋白样品的粘性,导致流速减慢,建议可将离心时间延长到原来的1.5倍。

十二：如何对超滤离心管进行去除内毒素的处理？

提供的超滤离心管是没有经过去内毒素处理的，同时由于内毒素通常以多聚体的形式存在，大小在10-1000KD之间不等，在超滤的过程中是无法去除的。可以实验前通过先用0.5M NaOH预清洗，随后用Milli-Q水/缓冲液清洗的步骤去除大部分内毒素。关于针对Amicon Microcon Centricon尝试过的内毒素去除方案，请垂询默克密理博技术。

十三：用浓缩后的蛋白做下游分析时发现有干扰，可能有哪些原因？

密理博超滤膜含有微量甘油。如果此成分干扰分析，可用缓冲液或Milli-Q水预清洗。如果干扰仍存在，用0.1N NaOH清洗，然后用缓冲液或Milli-Q水再次清洗后甩干。

十四：怀疑浓缩过程中目的蛋白和超滤膜之间可能存在非特异性吸附，如何改善？

密理博超滤离心管使用的是再生纤维素膜，这种材质是蛋白吸附zui低的超滤膜。但是对于一些疏水性蛋白或非极性蛋白，它们和膜的非特异吸附可能会增强，对于这种情况，可以尝试在实验前对超滤管进行封闭处理，也可以尝试换成Amicon Ultra0.5或2来进行实验，通过减小膜面积来降低非特异性吸附。