同时测定三聚氰胺和三聚氰酸（一）

本文通过LC-MS和戴安公司的混合基质柱WAX-1，对宠物食品和生物样品中的三聚氰胺和三聚氰酸进行了有效的检测，取得了理想的实验结果。

由于宠物食品被三聚氰胺和三聚氰酸污染，当三聚氰胺和三聚氰酸同时存在时会形成一种不溶结晶物，这种物质可能影响到肾脏功能，最近的研究发现很多宠物的死亡和健康问题是由此引起的，受污染的麦子、稻米和玉米可能被制成人类食物如面包、意面、婴儿食品等，所以对原材料包括可疑性动物组织中三聚氰胺和三聚氰酸的检测就十分重要。

现在对三聚氰胺和三聚氰酸的定量方法包括气质（GC-MS）和液质（LC-MS）。GC-MS的缺点是需要费时费力衍生化，而报道的LC-MS方法需要很长时间的梯度运行及柱子清洗。

本文介绍了一种灵敏、简单和高通量的LC-MS方法，使用稳定的同位素标记的内标物（ISTD）来定量，可同时测定三聚氰胺和三聚氰酸。

使用戴安公司最新开发的混合基质柱WAX-1来分离被分析物，此柱子利用疏水和离子交换混合作用机理来达到特殊的选择性和保留。色谱运行时间仅用8min，MSQ质谱检测器确保选择性和灵敏度。对于两种物质（2~200 ng/ml）的线性都能达到R2>0.9995。方法检出限（MDL）方面，三聚氰胺为3.97 ng/ml，三聚氰酸为3.32 ng/ml。

本文通过宠物食品提取物以及生物基质（猪肉和鱼肉组织的提取物）来验证方法的可靠性，宠物食品用快速、简单和自动的提取方法处理。生物样品来自美国FDA，并按规定方法处理。

实验条件

仪器及软件

戴安Summit HPLC系统：P680 泵；ASI-100 自动进样器；TCC-100 柱温箱；UVD-340 UV-Vis 检测器；戴安MSQ Plus单四极质谱检测器（ESI源）；Chromeleon 6.8色谱管理软件。

分析柱：戴安公司Acclaim 混合基质柱WAX-1（150×2.1mm, 5um）；流速：等度90%乙腈/10% 20mM pH4 醋酸铵缓冲液（v/v），0.25 ml/min；柱温：20℃；进样量：5ul。

MSQ质谱条件

分析模式：SIM带极性切换；锥孔电压：50 V；间隔时间：0.5 S，对于所有SIM通道；探针温度：500℃；扫描：4 SIM全程扫描，两个不同极性的全扫描（100~400 m/z,250 ms），见表1。三聚氰胺和三聚氰酸的结构以及全波段扫描的质谱图见图1。

图1.  全波段扫描三聚氰胺和三聚氰酸的质谱图。

1.  全程扫描

色谱条件

色谱方法开发

色谱优化

流动相组成：在HILIC模式下，高有机物浓度的流动相容易使极性物质保留更长，并在ESI条件的MS上有更大的响应。然而，在WAX-1柱上的分离由于有弱阳离子的交换，对流动相中离子强度和pH的改变很敏感。为了保持方法的重现性，需要合适的缓冲容量，所以选择10% pH4的醋酸铵。

缓冲液pH

当三聚氰胺和三聚氰酸同时存在于不同pH条件的不同基质（有机、离子或混合物）中，越是在疏水的环境下保留时间越长，这可以用离子交换机理来解释。pH对保留时间的影响效果见图2。

图2.  流动相pH值对保留时间的影响。

离子强度

戴安的WAX-1混合基质柱由于弱阳离子交换模式能为极性物质提供特殊的选择性，极性越大的化合物对流动相离子强度的依赖越大。如图3所示，通过将流动相的总离子强度从2.75mM增加到11.0mM，三聚氰酸的保留时间可以从12.42min减少到7.40min。